[发明专利]一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测掺假肉及其制品的多重PCR检测方法，具体涉及一种一次性快速检测肉及其制品中是否掺杂狐狸肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的快速检测方法。

背景技术

    近几年我国肉及其制品的消费量不断上升，涮羊肉、羊肉锅仔、羊肉串、牛肉干等都深受消费者的喜爱，而不法商贩利用检测手段的不足将廉价的鸡肉、鸭肉、猪肉甚至狐狸肉、老鼠肉等掺入羊肉及牛肉中销售，从中获取暴利，因此掺假肉及其制品的检测是一项重要工作，其关系到消费者的健康及生命安全。然而传统的检测方法检测时间长，耗时、耗力，难以适应大批量肉及其制品快速检测的需要，因此亟需建立一种操作简便、快速准确、经济适用、灵敏度好、特异性高的现代化检测方法。

    多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，其不同于传统PCR技术只能检测单一靶基因，它是在同一PCR反应体系里加入多对特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，因此可用于多种微生物的同时快速检测或鉴定，具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。目前该技术主要用于多种病原微生物的快速检测中，而对肉及其制品中掺杂狐狸肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的多重PCR快速检测方法未有报道和公开。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，特别是一种用于快速检测肉及其制品中掺杂狐狸肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的多重PCR快速检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

为实现上述目的，本发明首先根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2 ，即6条特异性引物：F1、F2、F3、F4、R1、R2。狐狸特异性引物F1/R1的长度为205 bp，老鼠特异性引物F2/R1的长度为283 bp，猪特异性引物F3/R1的长度为671 bp，鸡特异性引物F4/R2的长度为563 bp，鸭特异性引物F4/R2的长度为405 bp。各特异性引物具有高度中内保守、种间特异性等优点。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。

上述所述的狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉特异性引物如表1所示。

表1 PCR扩增狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉特异性引物

本发明提供了一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法包括以下步骤：

步骤(1).样品前处理

将肉类及其制品取样，加入10倍肉类及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；

步骤(2).样品DNA提取

    将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。

所述的TE缓冲液为1 ml 浓度为1 M 、pH值为 8.0的Tris-Cl，0.2 ml浓度为 0.5 M、pH值为 8.0的EDTA，定容至100 ml溶液。         

所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50 mM、 pH值为 8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25 mM，NaCl的浓度为100 mM，蛋白酶K的浓度为20 μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10﹪。

所述的第一混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25：24：1。

所述的第二混合溶剂为氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。

步骤(3).多重PCR扩增

将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。