[发明专利]一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的TaqMan Real-time试剂盒及其检测方法，具体涉及用TaqMan实时荧光定量PCR检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术

羊传染性脓疱皮炎病毒简称“羊口疮”病毒(Orf Virus,ORFV)，能引起羊属动物和人类接触性感染，甚至引发养羊业发展和环境安全问题。ORFV污染的环境对于幼年羊只和泌乳母羊存在极高的感染风险，它们主要侵害宿主皮肤或黏膜，并可导致其严重的持续性感染和继发性感染。ORFV拥有鲜明的种属特性和丰富的功能性基因，其基因组属于两端闭合的双股DNA，长约138kb，中央为核心区(88kb)，两端为反向重复序列(Inverted terminal repeat,ITR)，冠以环状发夹结构。中央核心区基因相对保守，主要调控病毒的复制、包装和输出。其编码的主要蛋白有dUTPase、42KDa蛋白、20KDa蛋白、DNA聚合酶、RNA螺旋酶、RNA聚合酶、RAP94、病毒粒子蛋白、后期基因转录蛋白、拓扑异构酶、后期基因反式作用子、核心蛋白等。近年该病在我国广泛流行，对养羊业及人类健康构成威胁。目前对ORFV难以防控的原因是多方面的，感染早期的诊断技术薄弱是主要原因。就目前ORFV的流行特点，要使其在流行病学方面得到控制，开展一系列的防控和净化工作势在必行。从经济角度上讲，国外检测试剂检测一份样品的价格往往是几十元甚至上百元人民币，成本过高导致养羊业主无法接受。目前检测羊传染性脓包皮炎病毒仅有普通PCR试剂盒，该试剂盒操作相对复杂，结果判定需靠电泳条带来确定，费时费力，而且电泳时凝胶中加入的溴化乙锭危害人体健康，操作时需格外小心。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、准确、快速、特异性和灵敏性好以及低成本的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法，本试剂盒及检测方法还适用于检测低微含量的羊传染性脓疱皮炎病毒。

本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，其特征在于，通过针对羊传染性脓疱皮炎病毒保守区域H2L基因设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，所设计引物和和探针序列如下：

上游引物：5’-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’

下游引物：5’-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’

探针：5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。

所述样品的DNA模板使用宝生物工程有限公司的型号为D824A的基因组DNA提取试剂盒进行提取。

所述实时荧光定量PCR的反应体系为：

1)Premix Ex Taq12.5μL；

2)上下游引物及探针，其浓度均为10μM，各取1μL；

3)样品的DNA模板3μL；

4)无RNA酶水6μL；

5）50×ROX Reference Dye0.5μL。

所述实时荧光定量PCR的反应条件如下：94℃预变性2min；94℃40s，54℃40s，72℃50s，40个循环。

本发明还提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，包括Premix Ex Taq；阳性对照；阴性对照；扩增引物与探针的混合物和50×ROX Reference Dye；

所述扩增引物与探针的混合物的序列如下：

上游引物：5’-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’

下游引物：5’-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’

探针：5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。

所述阴性对照为无RNA酶水。

所述阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒。

试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为10μM，体积配比为1:1:1。