[发明专利]一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法

说明书

本发明提供了一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法，该方法主要包括：对生物体液样本进行红细胞裂解处理；加入与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠进行孵育；用滤膜过滤细胞悬液，富集循环肿瘤细胞。本发明对红细胞裂解、免疫微珠法和滤膜法富集CTCs方法的综合及优化，从而极大地提高循环肿瘤细胞的富集效果，该技术对白细胞的去除效率>99.9%，肿瘤细胞的富集效率>80%。同时，本发明还提供一种使用上述循环肿瘤细胞的富集方法的试剂盒，以及提供一种用于富集循环肿瘤细胞的装置。本发明还提供了一种上述富集的循环肿瘤细胞的分析方法，通过该方法，可以实现肿瘤细胞数量、基因突变、基因表达谱等动态变化的分析。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法。

背景技术

目前认为，肿瘤微转移灶起源于侵入循环中的肿瘤细胞，因此，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)可能是肿瘤远处转移的一种标志。近年来，随着分子技术的发展，使得分离、计数外周血CTCs成为可能。在疾病早期阶段，CTCs可能有助于良、恶性肿瘤的鉴别，转移风险的预测和判断。在疾病进展期，CTCs或许可以提供重要的预后信息，以及帮助医生监测治疗效果。而且，CTCs可能反映肿瘤特征，能够指导治疗方案的制定，并且可以作为靶向治疗的靶标。

现有的CTCs富集方法通常是基于CTCs的表面标志物，如免疫磁性分选法，或CTCs的物理性质（密度和大小），如梯度离心法。其中，基于免疫磁珠的CellRearch是一种半自动化的CTCs检测仪器，该方法针对CTCs表面的标志物进行正向富集，2004年已被美国FDA批准用于预测乳腺癌患者的无病生存期和总生存期，但由于CTCs在体内生长过程中会出现丢失上皮细胞黏附因子表面抗原等CTCs表面标志物的现象，不能富集该部分CTCs细胞，在实际使用的局限性较大。

密度梯度离心法的具有简单、廉价、快速等优点，但分离的肿瘤细胞不纯，分离效率不高，有相当一部分肿瘤细胞丢失，在实际应用仍有很大局限。

发明内容

本发明目的之一是提供一种富集循环肿瘤细胞的方法，该方法可以很好地实现肿瘤细胞的富集。

实现上述目的的技术方案如下。

一种循环肿瘤细胞的富集方法，主要包括以下步骤：

1）对生物体液样本进行红细胞裂解处理以去除红细胞；

2）加入与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠进行孵育以去除

白细胞、血小板及残余的红细胞。

在其中一个实施例中，还包括步骤：3）将去除白细胞、红细胞后的细胞悬液在滤膜上进行过滤，得到富集循环肿瘤细胞的滤膜。

本发明中，所述生物体液样本包括但并不局限于以下来源：人或动物的外周循环血，胸腔积液，腹水，脐带血，羊水，骨髓，或培养的人或动物细胞。本发明中，所述免疫微珠由抗体与微珠表面进行共价或非共价偶联而成，所述微珠的直径介于10纳米-100微米，可以为磁性或非磁性，例如具体可以为含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三铁中一种或以上成分的微珠。

所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体，进一步地，所述的免疫微珠上偶联的抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中的两种或以上。

本发明中，所述滤膜孔径为5～8um，选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、或塑料薄膜。