[发明专利]带报告基因的BAC‑OC43冠状病毒载体系统的构建及应用

权利要求书

1.一种BAC-OC43重组病毒，其特征在于，所述的BAC-OC43重组病毒的构建方法包括以下步骤：

1)将带报告基因的pBAC-OC43质粒转染宿主细胞后，冻融裂解细胞即可获得能表达报告基因的重组病毒；

2)HCoV-OC43基因组NS2和NS12.9基因位置作为外源基因插入位点；

3)利用HCoV-OC43重组病毒的复制表达外源基因；

所述的HCoV-OC43重组病毒的构建及检测方法包括以下步骤：

(1)外源基因插入位置的选择

以GFP基因取代HCoV-OC43基因组的2个附属基因：NS2和NS12.9，

(2)酶切位点的选择和引物设计

所有HCoV-OC43相关的核酸序列均参考ATCC株，其Genbank编号AY585228，在选定外源基因插入位点后，在其两端选择了两个特异性的酶切位点用于携带GFP的外源片段的引入，如表1；根据选定的外源基因插入位点和酶切位点，设计引物分别扩增GFP以及插入位点与酶切位点之间的基因，引物序列如表2、表3所示，

表1 酶切位点的选择及位置

表2 GFP取代NS2引物列表

表3 GFP取代NS12.9引物列表

(3)融合PCR法构建带GFP重组片段

包含HCoV-OC43全长cDNA的载体pBAC-OC43FL，利用设计的引物，以pBAC-OC43FL、pCSCG为模板进行PCR扩增获得各基因片段，然后采用两步法融合PCR的方法进行三片段融合获得带GFP的重组片段，第一步只加模板不加引物，在复性温度为50～55℃下扩增10～13个循环，复性延伸片段之间的重叠部分，第二步取第一步反应的未纯化产物2～3μl，加入到新的PCR体系中，同时加入外侧引物，在复性温度为62～65℃下扩增25～30个循环扩增融合片段，得到两个各带GFP的重组片段，命名为NS2-GFP，片段长度为5Kb，NS12.9-GFP，片段长度为6Kb，分别代表GFP取代NS2基因和GFP取代NS12.9基因，融合PCR产物经纯化回收后利用酶切连接的方法克隆到pBluescript载体中；

(4)带GFP重组pBAC-OC43的构建

根据选定的酶切位点，分别用相应的限制性内切酶酶切携带有重组片段的克隆载体和pBAC-OC43^FL，前者经酶切后直接用胶回收纯化试剂盒纯化回收；后者酶切完成后，加入用热敏磷酸酶37℃孵育2小时，然后65℃20min失活，采用乙醇沉淀回收的方法回收；回收后的片段16℃过夜连接后转化DH10β细胞；

(5)重组病毒拯救

低代次的BHK-21细胞生长到90％，采用6孔板，取5μg携带GFP的重组pBAC-OC43质粒，按照质量体积比为1∶3的比例与脂质体2000混合孵育后加入细胞培养液中，37℃培养72h后换2％的DMEM维持液，放入33℃孵箱继续培养72h-96h；

(6)Western Blot和免疫荧光检测重组病毒

在33℃培养的不同时间点收获细胞，以β-actin为内参，HCoV-OC43N蛋白抗体血清检测不同时间点N蛋白的表达量，结果显示随着时间的延长N蛋白的表达量不断增加，证明了病毒的复制；以HCoV-OC43N蛋白抗体血清为一抗，罗丹明标记的羊抗鼠IgG为二抗对细胞进行免疫荧光检测，结果显示表达GFP蛋白的区域与红色罗丹明区域完全一致。