[发明专利]带报告基因的BAC‑OC43冠状病毒载体系统的构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和病毒学领域。更具体涉及一种携带绿色荧光蛋白的BAC-OC43冠状病毒载体系统的构建方法及应用。通过该方法，我们可以快速准确的对OC43基因组进行改造，同时也能方便的对病毒进行半定量分析，为深入研究该病毒的复制机制、致病机理、感染谱以及开发新型疫苗奠定了基础。

背景技术

冠状病毒属于巢状病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，因电镜下病毒颗粒形似王冠而得名。冠状病毒是病毒界的一个大家族，能感染从哺乳动物到禽类等一大批脊椎动物。根据国际病毒分类学委员会的最新规定，冠状病毒分为α、β、γ和δ4组，分别对应1组、2组和3组冠状病毒和新假定的一个属。α冠状病毒组包括人冠状病毒229E(HCoV-229E)、NL63(HCoV-NL63)以及一些动物冠状病毒如猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和犬冠状病毒(canine coronavirus，CCoV)等；β冠状病毒包括人冠状病毒0C43、SARS、HKu1以及新近发现的HCoV-EMC等人冠状病毒，还包括鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)和牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)等动物冠状病毒；γ冠状病毒组包括禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)和火鸡冠状病毒(turkey Coronavirus，TCoV)等。表皮细胞是冠状病毒感染的主要靶细胞，巨噬细胞等分布广泛的细胞也可被感染。冠状病毒的宿主范围相对比较局限，只感染它们的天然宿主以及密切相关的宿主。冠状病毒主要与呼吸道、肠道、中枢神经系统以及肝脏疾病有关，具有胃肠道、呼吸道或神经系统嗜性。冠状病毒感染人体后，还与胃肠炎、上呼吸道和下呼吸道感染有关。

1981年，Racaniello和Baltimore将包含脊髓灰质炎病毒全长cDNA的质粒DNA转染宿主细胞，成功构建了首个RNA病毒的全长cDNA克隆；随后，该技术得到了广泛的应用和发展，获得了许多RNA病毒的感染性克隆，包括正链和负链RNA病毒、分节段的和不分节段的RNA病毒。获得cDNA感染性克隆后，可以在DNA水平上通过突变、插入、缺失和互补等手段研究RNA病毒，具有非常广泛的应用前景。冠状病毒庞大的基因组以及携带其复制酶序列的质粒在细菌中的不稳定性长期阻碍了冠状病毒反向遗传学的发展，直到2000年Almazan等首次利用DI-RNA和BAC质粒系统成功构建了TGEV的全长cDNA感染性克隆。此后，通过体外将全场cDNA克隆到BAC载体、体外连接覆盖基因组全长的cDNA以及痘苗病毒载体等相继获得多个冠状病毒的感染性克隆。冠状病毒感染性克隆的构建成功为我们研究冠状病毒蛋白和基因组功能、致病机理、毒力关键位点、病毒载体的开发提供了一个非常好的平台。