[发明专利]哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的方法及其分离纯化方法

权利要求书

1.哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的方法，其特征在于它按以下步骤进行：

将哈工大异养硝化不动细菌L7(Acinetobacter Heteronitrifihit L7)菌株接种到产酶培养基中，接种量为2％，在160rpm/min、15℃培养14～24h，即完成哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶；其中产酶培养基的组分如下：NH₄Cl0.1g/L、CH₃CH₂ONa1.0g/L、NH₂OH0.7g/L、MgSO₄·7H₂O0.05g/L、K₂HPO₄0.2g/L、NaCl0.12g/L、CuSO₄·5H₂O0.01g/L、NaMoO₄·2H₂O0.05g/L、BaCl₂0.01g/L、MnSO₄·4H₂O0.01g/L、FeSO₄0.01g/L、K[Fe(CN)₆]0.01g/L、Cty C0.02g/L和余量的蒸馏水，pH值7.0～7.4。

2.根据权利要求1所述的哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的方法，其特征在于所述产酶培养基的组分中CH₃CH₂ONa可由丙酸盐或丁酸盐替代。

3.如权利要求1所述哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的方法的进一步分离纯化方法，其特征在于哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的分离纯化方法按以下步骤进行：

一、将哈工大异养硝化不动细菌L7(AcinetobacterHeteronitrifihitL7)菌株接种到产酶培养基中，接种量为2％，在160rpm/min、15℃培养14～24h，然后在6000rpm离心5min后收集菌体；

二、将菌体用10mmol/L、pH8.5的Tris-HCI缓冲液重悬后置于冰水浴中超声破碎15min，然后将破碎液采用溶菌酶对细胞进行破碎，将收集的菌体分为细胞质、细胞周质和细胞膜三部分，再通过渗透作用，制备不含溶菌酶的胞外基质；

三、应用DEAE-CL6B离子交换柱对收集的胞外基质进行分离，并用5mM、pH8.0的Tris-HCl进行平衡，在相同的缓冲液中，用0-500mM梯度NaCl进行洗脱，羟氨氧化酶在80mM的NaCl条件下从离子交换柱中洗脱下来，然后通过交联聚丙烯酰胺葡聚糖S-100凝胶层析去除细胞色素C₅₅₁，再变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集分子量60.4KDa的单体蛋白，即完成哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的分离纯化；

其中步骤一中产酶培养基的组分如下：NH₄Cl0.1g/L、CH₃CH₂ONa1.0g/L、NH₂OH0.7g/L、MgSO₄·7H₂O0.05g/L、K₂HPO₄0.2g/L、NaCl0.12g/L、CuSO₄·5H₂O0.01g/L、NaMoO₄·2H₂O0.05g/L、BaCl₂0.01g/L、MnSO₄·4H₂O0.01g/L、FeSO₄0.01g/L、K[Fe(CN)₆]0.01g/L、Cty C0.02g/L和余量的蒸馏水，pH值7.0～7.4。

4.根据权利要求3所述的哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的分离纯化方法，其特征在于步骤一中所述产酶培养基的组分中CH₃CH₂ONa可由丙酸盐或丁酸盐替代。