[发明专利]哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的方法及其分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及产酶的方法及其分离纯化方法。

背景技术

生物脱氮是目前国内外公认的最为有效、最具应用前景的去除水中氨氮污染的技术，也是当前水污染控制领域的研究重点与热点。无论是自养硝化菌还是异养硝化菌，在氨氮降解过程中，都会受到温度影响。环境温度降低将导致氨氮降解效果变差，尤其当温度低于15℃时，微生物停止生长而使得氨氮无法得到降解。我国北方地区冬季水温通常低于10℃，以黑龙江省为例，冬季水温最低在2℃以下，低温使氨氮去除成为难题。

水中的氨氮降解过程是由一系列氧化还原酶组成的电子传递链完成，其中羟胺氧化酶(Hydroxylamine oxidoreductase，HAO)将氨氮氧化形成的羟胺(NH₂OH)氧化成亚硝酸态氮(NO₂^--N)，在氨氮降解过程中起关键作用。自养硝化细菌(Nitrosomonas europaea)中的HAO存在于细胞周质中，是大约180kDa的血红素蛋白，包含3个63kDa的α亚基和3个11kDa的β亚基(Hooper，A.in Autotrophic Bacteria Biochemistry of the Nitrifying Lithoautotrophic Bacteria；Schlegel and Bowien，Eds，；Scinence Tech Publishers：Madison，WI1989；Chapter13，pp239-265)。在异养硝化菌中也分离出了HAO，但是不同菌株的HAO具有特异性。在异养硝化菌Thiosphaera pantotropha和Alcaligenes faecalis中分离出的HAO是20kDa的小型单体蛋白，存在于细胞周质中(Wehrfritz，J.M.，Reilly A.，Spiro S.et al.Purification of hydroxylamine oxidase from Thiosphaera pantotropha identification of electron acceptors that couple heterotrophic nitrification to aerobic denitrification.FEBS，1993，335：246-250；Otte，S.，Schalk，J.，Kuenen，J.G.et al.Hydroxylamine oxidation and subsequent nitrous oxide production by the heterotrophic ammonia oxidizer Alcaligenes faecalis.Appl Microbiol Biotechnol，1999，51：255-261)。在异养硝化菌Pseudomonas PB16中分离出的HAO是一个分量为132kDa的二聚体，含有两个68kDa的α亚基(Jetten M.S.M.，de Bruiin P.，Kuenen J.G.Hydroxylamine metabolism in Pseudomonas PB16：involvement of a novel hydroxylamine oxidoreductase.Antonie van Leeuwenhoek，1997，71：69-74)。以上分离出的HAO酶最适反应温度为25-35℃，在低温条件下，酶促反应速度迅速下降，成为低温下氨氮降解效果差的主要原因之一。因此，提高低温下羟氨氧化酶活性，分离低温下高活性羟氨氧化酶，对解除低温抑制作用，提高氨氮降解效果，具有重要意义。

发明内容

本发明目的是为了解决现有低温氨氮无法有效去除的问题，而提供哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的方法及其分离纯化方法。

哈工大异养硝化不动细菌L7产低温羟氨氧化酶的方法，按以下步骤进行：