[发明专利]一种重复串联表达GP5优势抗原表位检测PRRSV抗体的间接ELISA方法

权利要求书

1.一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白，其制备方法为：

1）获得一种重组DNA，该重组DNA具有如权利要求1所述氨基酸序列反翻译过来并经密码子优化的核苷酸序列，其序列如SEQ ID No.2所示；

2）将步骤1）的重组DNA利用基因工程重组技术构建能够分泌表达GP5蛋白优势抗原表位的基因工程质粒pGEX-6p-GP5；

3）将质粒pGEX-6p-GP5转入宿主大肠杆菌BL21成为基因工程菌BLpGEX-6p-GP5，将BLpGEX-6p-GP5在LB培养基中培养，利用IPTG诱导表达并进行条件优化，所表达的蛋白经分析该重组蛋白为分泌表达型；

4）将重组蛋白通过亲和层析柱进行纯化后复性。

3.如权利要求2所述的一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白的制备方法：其特征在于获得步骤1)所述重组DNA的方法是：根据已经鉴定的PRRSV抗原线性保守表位GP530和高变异性优势表位GP5190的氨基酸特征，设计2个拷贝数的重复序列进行串联表达，并在序列中引入EcoRI限制性酶切位点和XhoI限制性酶切位点。

4.如权利要求1所述的一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白在测定猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用。

5.一种测定猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA方法，其特征在于所述ELISA方法的具体测定步骤为：

a、包被：将纯化复性后的重组蛋白用抗原包被液稀释至含重组蛋白7.5ug/mL的终浓度，每个ELISA孔加入100uL，4℃包被过夜，PBS-T缓冲液洗涤5min，重复三次；所述的抗原包被液为0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液；所述BPS-T缓冲液为含终浓度0.01% Tween-20的PBS缓冲液；

b、封闭：每空加入5%脱脂奶粉的PBS-T封闭液100uL，37℃作用2h，PBS-T缓冲液洗涤5min，重复三次；

c、加待检血清：每孔加入100uL用抗体稀释液1:100倍稀释的猪血清，37℃作用2h，PBST缓冲液洗涤5min，重复三次；

d、加酶标二抗：每孔加入100uL用抗体稀释1：3000液稀释的兔抗猪IgG/辣根酶，37℃作用2h，PBS-T缓冲液洗涤5min，重复三次；

e、加显色液：每孔加入100uL含1mg/mL四甲基邻苯二胺的显色液，37℃作用15min；

f、加终止液：每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定OD450值；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；

g、结果判定：待检血清OD450值≧0.254时，判定为PRRSV抗体阳性；待检血清OD450值﹤0.212，判定为PRRSV抗体阴性；0.212≦待检血清OD450值﹤0.254时，判为可疑，需重新检测；若重新检测待检血清OD450值仍然为在0.212≦待检血清OD450值﹤0.254时，判为阴性。