[发明专利]一种重复串联表达GP5优势抗原表位检测PRRSV抗体的间接ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，属于动物传染病学领域。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）是由 PRRS 病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状为特征的高度接触性传染病。该病于1987年在美国首次被报道，并迅速蔓延到世界各地，给生猪养殖业造成巨大的经济损失。我国台湾地区1991年首次发现该病，1996年郭宝清报道我国内的有该病流行，目前仍是危害我国养猪业的重要疫病。

PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，目前有2个血清型：美洲型和欧洲型。基因组大小约为15kb，包含8个开放阅读框（ORFs） 。其中ORF5编码的病毒糖基化囊膜蛋白GP5蛋白是PRRSV的主要结构蛋白，参与病毒入侵宿主细胞的过程，并诱导产生中和抗体。此外，GP5蛋白还具有诱导细胞凋亡、参与病毒粒子结合病毒受体的过程等作用。因此，GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义，是研制基因工程疫苗的最近候选基因。

GP5是由ORF-5编码的N端糖基化囊膜蛋白，GP5蛋白核苷酸序列不同毒株间变异较大。同型毒株间氨基酸的同源性在88-99%之间，而欧洲型和美洲型氨基酸同源性只有55%左右。在成熟病毒粒子中，通常与M蛋白通过二硫键以异二聚体形式存在。GP5的免疫原性与M蛋白、N蛋白相似，只是在PRRSV感染细胞内表达水平较低。体外中和试验均已证明抗GP5抗体具有中和活性，GP5蛋白在诱导PRRSV特异性细胞凋亡有关。

欧洲型和美洲型GP5之间存在有共同抗原表位，也存在型独特性表位。GP5上至少存在2个线性中和表位，但也有构象决定簇。根据GP5特异性单抗抗GP5蛋白缺失突变株及与蛋白3个亲水区序列一致的合成短肽的反应性，确定了2个PRRSV抗原性有重要作用的区域：位于胞外区（aa27-41）和位于C端（aa180-197）。Ostrowshi利用噬菌体展示技术，筛选到2个表位：一个线性保守中和表位（表位B）可被单抗识别又能被猪抗PRRSV中和血清识别；另外一个是高变异性免疫优势表位（A）（Ostrowski M, Galeota J, Jar A, et al. Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain[J]. J Virol, 2002, 76(9):4241-4250.）。此外，有研究发现，GP5蛋白aa170-201与PRRSV阳性血清具有良好的反应性，且该区域在2个PRRSV型间高度保守，可用于快速诊断，针对这个表位的单抗可以中和病毒，降低其致病力。 

发明内容

本发明是将表位A和表位B进行重复串联后克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上，进行条件优化表达，成功表达出可溶性的具有GP5优势抗原表位的融合蛋白，并进行纯化。经过Western blot 和间接ELISA结果均表明，所表达的融合蛋白均有较好的生物学活性，可用于PRRSV感染的血清学诊断。

本发明提供一种重组蛋白，以及一种基于该重组蛋白的用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，即：利用pGEX-6p-1原核表达载体，利用已经筛选到的PRRSV GP5蛋白的一个线性保守中和表位（表位B）可被单抗识别又能被猪抗PRRSV中和血清识别；另外一个是高变异性免疫优势表位（A），为提高表达蛋白的抗原活性将两个表位进行重复串联，构建了能够分泌表达GP5蛋白优势抗原表位的基因工程菌BLpGEX-6p-GP5，并将表达的重组蛋白纯化复性后包被ELISA板，用以检测猪血清中PRRSV的抗体水平，结果表明该方法具有重复性好、特异性高的特点，可用于PRRSV血清学调查。

本发明提供的技术方案为一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1：

NASNDSSSHLGSGSTRVSAEQWGRPGGGSNASNDSSSHLGSGSTRVSAEQWGRP。

其制备方法为：