[发明专利]一种齐考诺肽的固相合成方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种齐考诺肽的固相合成方法。

背景技术

齐考诺肽(ziconotide)是ω-芋螺毒素MVIIA的合成形式，天然型存在于南太平洋海洋蜗牛(Conusmagus)体内，是由25个氨基酸组成的阳离子多肽，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基，分子量为2639.12。

它是强效的、特异性、选择性、可逆的的N型电压敏感性钙通道(N-type voltage-sensitive calcium channels,N-type VSCCs)阻滞剂，可阻止脊髓初级疼痛传入神经元上钙离子的涌入，抑制神经递质如P物质、降钙素基因相关肽以及谷氨酸等的释放，从而阻止或降低疼痛信号的传导，对其他离子通道没有明显的亲和力。鞘内注射齐考诺肽可以阻断初级伤害感受器的传入神经递质的释放，同时阻止疼痛信号从脊髓向脑部传导，从而产生镇痛作用。长期给药不会引起耐受性，优于鞘内注射吗啡，可用于治疗难治性、阿片类药物无效或已产生耐药性的病例。一系列的临床实验已经证明鞘内注射齐考诺肽可以治疗带状疱疹后遗神经痛，幻肢痛，HIV相关神经病理性疼痛，难治性癌痛，手术后疼痛。而且齐考诺肽不与阿片受体、胆碱能受体、单胺类受体或肽能受体结合。

此外，齐考诺肽仍存在部分副作用，表现为：头晕，恶心，眼球震颤，步态异常，便秘，尿潴留，嗜睡，体位性低血压，呕吐，思维混乱，视力异常。头晕，恶心，思维混乱，头痛最为常见。通过剂量调整和缓慢滴定，其副作用是可控，可逆的。有精神病史的病人不能用齐考诺肽治疗。对有精神缺陷、幻觉情绪改变的病人要严密监护。如果有精神问题发生，应当终止齐考诺肽治疗并改用精神药物治疗。

2004年美国食品及药物管理局批准其用于鞘内注射治疗，主要适用于其他治疗方法不能耐受或不能控制的严重慢性疼痛患者。在欧洲，齐考诺肽也被允许用于严重慢性疼痛患者的治疗。2007年，联合镇痛会议专门小组推荐齐考诺肽作为一线鞘内镇痛药物。

生物提取现受到现有有限生物资源的影响，提取过程较繁琐，效率低，且比较难得到高纯度的产物。低温自然成环反应属于热力学控制，环化过程慢，过程控制较复杂，反应收率低。

齐考诺肽的合成技术主要是液态合成法，很少有固相合成法的报道。其相关专利主要集中在药理和治疗方面，如US2007269528，US2006234936，LU91181。

2007年中国专利局公布一篇相关专利CN101412752A介绍了一种采用Fmoc策略固相合成齐考诺肽的方法[1]，合成路线如下：该方法以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体，以HOBt和DIC为缩合剂，依次将侧链保护的氨基酸连到树脂上，得到含25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中形成二硫键的三组Cys分别由Trt、Acm、Mob保护，不同组Cys由不同的保护基保护，同组Cys由同一种保护基保护。将线性全保护肽树脂溶于1％的TFA/DCM溶液，室温反应20分钟脱去Trt保护基，过滤后加入水、乙腈、DMSO（体积比10:15:1），稀氨水调节pH至8，室温下搅拌反应4小时，得到齐考诺肽一环肽树脂。将得到的一环肽树脂中加入0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液，室温反应2小时，洗涤过滤得到齐考诺肽二环肽树脂。将得到的二环肽树脂溶于三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇（体积比：80:8:8:4）混合溶液中，室温反应3小时，过滤沉淀后得到齐考诺肽二环肽粗品。将得到的二环肽粗品溶于水中，调pH至8，双氧水存在下室温反应一小时，得到齐考诺肽三环粗肽，HPLC制备纯化得到齐考诺肽。

整个合成过程反应流程如图1所示。

该方法的优势在于采用纯固相方法，操作比较简单。但是，在固相条件下完成前两个二硫键的氧化，重复难度很大；切割肽树脂时，容易导致两对二硫键的断裂和重排而使产物纯化复杂；最后一步双氧水作用的环化过程中肽浓度要求非常低，不适于商品化大规模生产，并且该过程很容易形成二聚物或多聚物。