[发明专利]快速分离扩增神经干细胞的培养基及方法

说明书

技术领域

本发明涉及快速分离扩增神经干细胞的培养基及方法。具体而言，本发明涉及调整了pH值的神经干细胞专用培养基及相应的培养方法。

背景技术

对于包括帕金森病、阿尔茨海默病、脑卒中、恶性神经胶质瘤及中枢和外周神经损伤等神经系统疾病，长期以来均缺乏有效的治疗手段。常规临床治疗方法主要是以减少或防止继发性损伤为主，基本上没有治愈的可能。上世纪90年代神经干细胞的发现对上述神经系统疾病的治疗带来了希望。

神经干细胞具有自我更新、自我复制的特性。目前已在多种动物模型及人体中尝试过将神经干细胞移植到纹状体等脑神经病变部位及受损伤的脊髓中，并获得一定疗效。但要广泛地开展神经干细胞治疗神经系统疾病，神经干细胞的来源和数量仍是制约其广泛应用于临床治疗领域的主要难点。

对于神经干细胞的提取、培养、纯化、诱导等方面已积累了一定的经验，但神经干细胞一般需培养一周时间才能形成神经干细胞凝集体。因此，神经干细胞的分离培养依然存在着培养周期长、产量相对较低的难题。

因此，建立一种快速分离扩增神经干细胞的方法，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于解决神经干细胞分离培养过程中存在的培养周期长，产量相对较低的问题，提供一种快速分离扩增神经干细胞的培养基和方法。

因此，本发明的第一方面涉及一种神经干细胞专用培养基，其基础成分与DMEM/F12培养基相同，其特征在于其pH值为6.9-7.1，并含有终浓度为5-30ng/ml的bFGF和EGF以及终浓度0.5-3%的维生素B27。

优选地，pH值6.95-7.02，更优选地，pH值为7.0。

优选地，所述pH值通过添加碳酸氢钠获得。

优选地，所述bFGF和EGF的终浓度为20ng/ml，所述维生素B27的终浓度为1%。

本发明的第二方面涉及一种神经干细胞的分离扩增方法，其包括步骤：

A）按常规方法获得神经干细胞的单细胞悬液；

B）将获得的单细胞悬液经不锈钢网过滤；

C）将DMEM/F12培养基pH值由呈酸性的pH5.9，经生理可耐受的碱性物质调节为中性或弱碱性；

D）分别加入终浓度为10-30ng/ml的bFGF和EGF，以及终浓度0.5-3%的维生素B27加入到DMEM/F12培养基中；

E）将0.5-1.5×10⁷/ml单细胞悬液加入到上述含有bFGF、EGF和B27，并且pH为中性或弱碱性的DMEM/F12培养基中，置于5%CO₂培养箱中于37℃潮湿环境中进行培养。

优选地，所述生理可耐受的碱性物质是碳酸氢钠。

优选地，所述中性或弱碱性为pH值6.9-7.1，优选地，pH值6.95-7.02，最优选地，pH值7.0。

优选地，所述bFGF和EGF的终浓度为20ng/ml，所述维生素B27的终浓度为1%。

优选地，获得单细胞悬液的方法可以是采用机械吹打或研磨的方法。

优选地，所述的单细胞悬液过滤所采用的不锈钢筛网是80或200目。

换言之，本发明的目的在于解决现有神经干细胞分离培养过程中存在的培养周期长、产量相对较低的问题，提供一种快速分离扩增神经干细胞的培养基和方法。

本发明的神经干细胞培养基与现有技术的神经干细胞培养基的成分基本相同，主要区别点在于其pH值被调整为中性或弱碱性pH值。优选地，所述pH值为6.9-7.1，更优选地，所述pH值为6.95-7.02，最优选地，所述pH为7.0。优选地，用碳酸氢钠调节所述pH值。

本发明的神经干细胞的快速分离扩增方法的步骤为：

A）单细胞悬液的制备：将含神经干细胞的组织或神经干细胞凝集体离心后，通过吸管机械吹打或毛玻璃研磨的方法获得单细胞悬液；

B）过滤：将获得的单细胞悬液经不锈钢网过滤；

C）调节DMEM/F12培养基酸碱度（pH值）：将DMEM/F12培养基pH值由呈酸性的pH5.9，经生理可耐受的碱性物质如碳酸氢钠调节为中性或弱碱性，使DMEM/F12培养基颜色由淡黄色变为粉红色；

D）添加生长因子：分别加入终浓度为20ng/ml的bFGF和EGF，并将维生素B27按照1:100稀释加入到DMEM/F12培养基中；