[发明专利]一种RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法

权利要求书

1.一种RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法，所述方法包括：

（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25～40mer的单链寡核苷酸DNA，记为引物A；该引物的GC含量为40～60%，解链温度为70～85℃；或者，若目标RNA为带poly(A)末端的mRNA，则引物A选用长度为29～50mer的Oligo(dT)；将引物A固定在PCR管内，得到固定PCR管；

（2）取待测样本，加入添加有表面活性剂和RNA酶抑制剂的裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；

（3）取裂解上清液20uL至固定PCR管中，50～60℃保温10～30min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤1次，吸干，加入20uL由RT酶、dNTP和RT缓冲液配制的RT反应液，42℃保温0.5～1小时；

（4）吸干管内液体，加入20uL由耐热DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析或琼脂糖凝胶电泳分析；

（5）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）～（4）的方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述裂解液组成如下：4.0mol/L异硫氰酸胍，350mmol/L NaCl，1%Triton X-100，10mmol/L2-巯基乙醇，0.1mg/ml鱼精DNA，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）所述RT反应液组成如下：75mmol/LKCl，3mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.5mmol/L dNTP,5U/20ul MMLV RT酶，溶剂为50mM、pH8.3的Tris-HCl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述PCR反应液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.05%Tween20，0.4×SYBR Green I，0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/L PCR引物，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。