[发明专利]一种RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法。

（二）背景技术

RNA是遗传信息传递的载体。RT-PCR（reverse transcription–polymerase chain reaction），指将RT（Reverse Transcription，逆转录）和PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）反应组合在一起的方法.RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成，即RT，同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RNA的RT-PCR检测或定量分析，比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作，已发展成为进行基因表达水平的检测分析，病原体的检测分析等方面的有力手段。

RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+RNA。RT需要用RT酶（如MMLV,AMV等），可以用随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT和PCR可以在两个反应管中分步先后进行（两管法），也可以在一个反应管中先后进行（一管法）。两管法比较常见，在两管法RT-PCR中，每一步都可以尽量在最佳条件下进行，但由于RT体系中含有PCR抑制物，所以一般只能取出约5%的RT产物进行PCR，这限制了最终检测的灵敏度。在使用一个样品检测多个目标RNA时，二管法比较很有用——因为一个RT产物可以分别用于很多个PCR反应。一管法指的是RT和PCR在一只管中进行，必须尽可能地提供同时为RT和PCR优化的条件。一管法在处理大量样品时易于操作，并有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一管法优化成功的话，可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增--理论上灵敏度可以比两管法提高20倍。然而，由于RT反应和PCR反应的最优反应条件是不一致的，现在市场上的一管法RT-PCR的条件优化较难掌控，经常会产生严重的非特异扩增，而且成本/售价上比传统的二管法有较大提升。

虽然RT-PCR在科研领域的推广普及程度很高，但在临床检测应用方面，仍存在很大的改进空间；主要问题包括:RNA提取和纯化的步骤繁琐，一般需要额外的DNase酶消化去除痕量的基因组DNA的步骤；2种酶促反应（RT和PCR）具有不同的最优反应条件，容易受到各种抑制物质的影响，也容易受到非特异扩增和假阳性等困扰；因此，总体上操作的复杂度和难度较高，不利于临床检测推广应用。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种操作简单、特异性强、效率和成功率高的用于RNA检测的一步裂解一管RT-PCR方法。

本发明采用的技术方案是：

一种RNA的一步裂解一管法RT-PCR检测方法，所述方法包括：

（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25～40mer的单链寡核苷酸DNA，记为引物A；该引物的GC含量为40～60%，解链温度为70～85℃；或者，若目标RNA为带poly(A)末端的mRNA，则引物A选用长度为29～50mer的Oligo(dT)；将引物A固定在PCR管内，得到固定PCR管；引物A的固定可以采用本领域常规方法进行，用于固定引物A的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质；

（2）取待测样本，加入添加有表面活性剂和RNA酶抑制剂的裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液为本领域常规添加有表面活性剂（如：脱氧胆酸钠、Triton X-100、NP-40等）和RNA酶抑制剂、用于细胞或组织裂解的缓冲液；待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等；

待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下：1～5ml痰液+5～10ml痰融解液，37℃振荡10min，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，取沉淀+200ul裂解液，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰溶解液组成:PBS+0.1%（w/vol）DTT。

待测样本来自细胞时，裂解上清液获得方法如下：24孔板细胞培养，吸去培养液，加入200ul裂解液，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，室温振荡10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；