[发明专利]一种快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法

权利要求书

1.一种快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法，按照下述步骤进行：

A、固定：将采取的植物根样在尼龙网中清洗干净，按每5g取根样倒入FAA固定液 50 ml，并用玻璃棒轻压根样，使其完全浸泡在FAA固定液中，固定4 h以上；如果采集植物根样后可以立即进行下一步处理，则可省略该步骤；

B、消化：将采集的植物的根样或FAA固定液中的根样冲洗干净后，按每5g根样加入10％W/V KOH溶液50 ml，在121 ℃高压灭菌5~10 min，以除去根中的细胞质，经过消化后根呈透明状，以便于染色观察；

C、漂洗：在室温冷却后，将根从KOH溶液中取出，用蒸馏水冲洗干净，若KOH处理后根的颜色为褐色或深黄色，则将根样置于250 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入H₂O₂漂洗液100 ml中，H₂O₂漂洗液为分析纯，有效含量不少于3% W/V，漂白根样5~10 min；若在消化处理后的根样为无色或半透明状，则可以省略漂洗步骤，直接进行下一步的酸化处理；

D、酸化：然后将根置于150 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入1％W/V  HCl 50 ml，酸化3～5 min；

E、染色：将根取出冲洗干净后置于150 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入0.1％W/V 台盼蓝染色液50 ml，煮沸10min；

F、脱色：待冷却后，将根取出，用蒸馏水冲洗掉染色液，然后将根置于250 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入50％W/V 乳酸溶液100 ml，脱色10 min以上；

G、观察：将染色后的根段切成1 cm，于光学显微镜下观察，凡出现菌丝、孢子或者丛枝等AMF结构，就将其计成已被侵染根段，计算AMF根侵染率。

2.根据权利要求1所述的快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的FAA固定液配制方法为50％W/V乙醇、甲醛、冰醋酸按体积比为85:10:5，混匀，试剂瓶盛放，常温保存。

3.根据权利要求1所述的快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的H₂O₂漂洗液为H₂O₂，分析纯，有效含量不少于3%W/V且不大于100%，稀释10倍。

4.根据权利要求1所述的快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的脱色液为乳酸、甘油和蒸馏水按体积比为1:1:1，混匀后用试剂瓶保存。

5.根据权利要求1所述的快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的0.1％W/V台盼蓝染色液为按每0.3 g Trypan blue 溶于300ml脱色液中，混合均匀。

6.根据权利要求1所述的快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的根样为草本、木本植物和灌木的根样。

7.根据权利要求1所述的快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的根样为酢浆草根样、狗尾草根样、大叶黄杨根样或加拿大一枝黄花根样。