[发明专利]一种快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速高效对植物根部丛枝菌根真菌进行染色观察的方法，属于应用微生物学领域。 

背景技术

菌根是土壤中某些真菌与植物根的共生体。丛枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhizal Fungus，AMF）是自然界中一类分布广泛的土壤微生物，它可以与约90%的陆生维管束植物的根形成一种互惠共生体——丛枝菌根。丛枝菌根的作用主要是扩大根系吸收面积，增强对原根毛范围外的元素（主要是磷）吸收。菌丝与植物组织互通，一方面从寄主植物中吸收糖类等有机物质作为自己的营养，另一方面又从土壤中吸收养分、水分供给植物。丛枝菌根真菌不但能够改善寄主植物矿质营养，促进植物生长发育，还具有缓解干旱、盐碱和温度胁迫等多种逆境对植株造成的危害。最新的研究成果表明，自然生态系统中菌根真菌影响植物种群的竞争能力，菌根真菌的多样性决定着植物的生物多样性、生态系统的变化以及植物的生产力。因此菌根学逐渐的兴起。而菌根生长状况观察与侵染率测定是菌根学研究中一项重要的基础性工作。由于几乎所有的菌根真菌接种试验均会涉及到菌根发育状况观察与侵染率测定，因此半个多世纪以来人们十分重视其观察与测定方法研究，相继建立了一系列的染色法来观察菌根真菌的发育状况，其中应用最多的是台盼蓝染色法和酸性品红染色法。 

酸性品红法将根段或经过FAA固定的根系经KOH透明、乳酸或2% （W/V）HCL酸化后置于90℃的酸性品红染色液染色20~60 min，乳酸分色后镜检。该方法操作简单，然而由于根皮层也被染上相同或略浅的颜色，导致颜色反差不明显，并且苯酚具有一定的毒性，对身体和环境具有一定的毒害。 

台盼蓝（Trypan blue）染色法是先将经过FAA固定的根系浸入10％（W/V）KOH溶液中，90 ℃消化1～2h经过消化后根呈透明状，然后将根浸入1％ （W/V）HCl中酸化3～5 min。将根取出冲洗干净后，浸入0.1 ％（W/V）台盼蓝（Trypan blue）染色液中，90 ℃保温10～20 min。将根取出，冲洗掉染色液。然后将根浸泡在50％乳酸溶液中脱色。经过染色的根能够在此溶液中保存数周时间。台盼蓝染色法染色效果稳定可靠，但是在KOH溶液透明处理时不易透明彻底，导致染色时丛枝菌根真菌与皮层之间的颜色反差小，不利于对AM真菌细微结构（如丛枝）的显微拍照。并且固定和消化时间过长，当天不能观察菌丝形态，不利于方便快捷的对根部的AM真菌侵染情况进行观察研究。 

除了上述两种方法外，氯唑黑E 染色法也用作AM真菌侵染情况的观察研究。该法将经KOH处理的根系置于等体积的85%乳酸、甘油和水溶解的0.1%（w/v）氯唑黑E混合溶液中90 ℃下浸泡1h以上，甘油脱色。镜检时用 2% 三氯甲醛作浮载剂。该法清晰度高、反差大，丛枝结构清晰，但氯唑黑E 被认为是致癌疑似物而存在不足。 

本发明针对当前菌根研究日趋受到重视，但是菌根染色方法存在染色效果较差并且操作时间较长的问题，通过121 ℃消化缩短了操作时间，并新增H₂O₂漂白处理工艺强化了染色的清晰度和层次性，从而显著提高了染色效率和染色效果。本方法具有方便、快捷、适应性强的特点，在菌根真菌研究领域具有很强的实际应用价值。 

发明内容

本发明的目的在于通过增加高温（121 ℃）消化和H₂O₂漂洗的步骤，对传统的菌根真菌台盼蓝染色方法进行改进，从而缩短了总体染色时间，增强了染色效果，开发出一种方便、快捷、适应性强的菌根染色方法，解决了目前菌根研究中存在的染色层次不清、图像模糊、操作时间过长等问题，实现菌根的快速高效染色，为菌根研究者提供一种行之有效的染色方法，具有较强的实际应用价值和科研理论价值。 

本发明的技术方案如下： 

A、固定：将采取的植物根样在尼龙网中清洗干净，取根样（该专利适用性强，绝大部分草本植物、木本植物和灌木的根样均可）置于150 ml三角烧瓶中，按每5g根样倒入FAA固定液约50 ml，并用玻璃棒轻压根样，使其完全浸泡在FAA固定液中，固定4 h以上；如果采集植物根样后可以立即进行下一步处理，则可省略该步骤；

B、消化：将采集的植物的根样（或FAA固定液中的根样）冲洗干净后，将根样置于150 ml三角烧瓶中，按每5g根样加入10％（W/V）KOH溶液约50 ml，在121 ℃高压灭菌5~10 min，以除去根中的细胞质，经过消化后根呈透明状，以便于染色观察；