[发明专利]肝损伤新诊断标志物调钙素的ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测试剂，特别是一种检测肝损伤患者血清中调钙素水平的ELISA检测试剂盒及检测方法。

背景技术

肝脏炎症是各种原因损伤肝脏的共同后果，尤以各种病毒感染、药物损伤等因素多见。我国是HBV感染的高流行区，乙肝表面抗原阳性率为7.18%，而HCV感染者大约为3800万，近年来由于生活方式改变等多种因素的影响，酒精性肝病及非酒精性脂肪性肝病等亦有明显增多。HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌，是主要的疾病死亡原因之一。因此，病毒性肝炎仍然是严重威胁我国广大人民群众健康的最主要传染病之一。

肝脏炎症损伤程度对确定患者的诊断和治疗非常重要，例如对于慢性乙肝炎患者，肝脏炎症是进行抗病毒治疗的重要指征。目前，临床上广泛应用的肝脏损伤血清学指标主要是谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）。多项研究表明，血清转氨酶水平与肝脏炎症程度常常不一致。在转氨酶正常的慢性无症状HBV感染者中，肝组织完全正常的仅占极少数，大约90％左右的感染者有不同程度的肝组织炎症及纤维化。王福生等发现在86例血清ALT持续正常、HbeAg阴性的慢性乙肝感染者，组织病理均表现为不同程度的炎症，其中达G2级以上者站16.3%。而何金秋等发现在46例ALT正常的慢乙肝患者中，有20例（43.5%）患者肝组织炎症分级达G2级以上，而38例ALT轻度升高（1-2倍正常值上限）的患者中，28例（73.7%）达到G2级以上。由此可见，ALT和AST作为目前仅有的肝脏炎症指标，其临床意义具有一定的局限性。基于这一点共识，临床医生常常需要对患者进行肝活检病理组织学检查，以明确肝脏炎症的真实情况。但该检查为创伤性检查，患者不愿接受，并且由于难以重复进行，不适合作为诊断和疗效判断的常规手段。此外由于“酶胆分离”现象的存在，转氨酶对重型肝炎的诊断意义更差。因此，临床上迫切需要其他更灵敏准确的血清学指标来进行辅助诊断，弥补转氨酶的不足。

调钙素（regucalcin）是肝细胞胞浆中的一种可溶性蛋白质，含量非常丰富，占肝脏可溶性蛋白总量的2%，在肝脏损伤时可释放入血，国外研究表明调钙素在ALT正常的肝炎患者血清中升高，并且在重型肝炎患者血清中亦显著升高，提示其有可能作为反映肝脏炎症的新的血清标志物。人类调钙素基因位于染色体Ｘｑ11.3－11.23，cDNA长度为1438bp，分子质量为33KD。调钙素主要分布在肝细胞的细胞质、细胞核及肾近曲小管的刷状缘等处，提示与肝肾疾病密切相关。调钙素与衰老有关，因此又被称为衰老标记蛋白（Senescence marker protein-30）。调钙素在多种组织、细胞内发挥着重要的生理作用，最主要的作用是调节细胞内钙稳态，此外还具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白丝氨酸和（或）苏氨酸磷酸酶的作用，从而影响蛋白质磷酸化－去磷酸化这一细胞内重要的调节功能。调钙素还具有抑制细胞增殖的作用。

Yamaguchi M等研究发现，当间断给予大鼠CCL₄诱导肝损伤时，ALT、AST等指标在第3天和第6天显著升高，在第18天和30天时恢复正常。而调钙素除了在第3天和第6天显著升高，在第18天和30天时仍显著高于正常，这与组织学恢复速度相吻合。Isogai M等予大鼠腹腔内注射半乳糖胺或者CCl₄灌胃同样引起大鼠血清中ALT、AST和调钙素显著升高。Yamaguchi M等还检测了42例肝病患者血清中调钙素水平（包括急慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者），发现血清中调钙素水平与ALT水平不完全平行，其中18例ALT和AST水平正常，而调钙素水平却显著升高，其浓度为3.7～69.6ng／ml。正常人血清中则不能检测到调钙素。Wei L等应用蛋白质组学和WB的方法研究发现，调钙素只在急性肝衰竭小鼠血浆中升高，并且仅在存活的小鼠中恢复至正常水平，而在正常小鼠为阴性。采用WB法对4例急性肝衰竭患者血清进行检测显示，患者血清中调钙素是正常人的3.65±0.34倍。因此，Wei L等认为调钙素在急性肝衰竭中不仅具有诊断意义，而且也有可能协助判断预后。

但遗憾的是国内外尚没有检测血清调钙素的试剂盒，极大地限制了临床应用及科研研究。目前有关该标志物与肝细胞损伤之间的关系仍然缺乏系统的对照研究，对肝衰竭患者相关研究仅进行了4例血清学WB检测。显然，评价调钙素的临床意义急需标准规范的试剂盒，尽管该课题组前期进行了一些研究，但由于某些限制，蛋白及抗体等未进行纯化，因此建立的双抗体夹心ELISA检测方法有待进一步优化。