[发明专利]一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法

权利要求书

1.一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

第一步、标准品β-变形细菌的预处理：

(1)将冷冻的β-变形细菌标样放入LB液体培养基中，37℃恒温培养，得到复苏的β-变形细菌标样；

(2)大肠埃希氏菌感受态细胞的制备；

(3)将复苏的β-变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养；

(4)通过质粒抽提试剂盒对步骤(3)所得物进行质粒提取，得到β-变形细菌质粒原液；

(5)利用超微量核酸蛋白测定仪测定步骤(4)所得的β-变形细菌质粒原液的DNA含量；

第二步、待测生物膜β-变形细菌样品的预处理：

(1)将从水处理工艺或管道内壁采集的生物膜样品加入灭菌生理盐水中，经超声预处理，利用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；

(2)提取完毕后，直接采用0.7％的琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳鉴定提取的DNA；

第三步、实时荧光定量PCR检测：

(1)标准品β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：

根据β-变形细菌质粒原液的DNA含量，将β-变形细菌质粒原液分别稀释成DNA含量为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μl的β-变形细菌质粒稀释液，根据PCR反应体系测定对应的β-变形细菌质粒稀释液的循环阈值；

根据检测结果得到β-变形细菌的循环阈值与DNA含量的对应关系，制作标准曲线方程y＝-ax+b，其中，y为循环阈值，x为DNA浓度以10为底的对数；

(2)待测生物膜β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：

根据PCR反应体系测定预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品的循环阈值，根据标准曲线得到样品中β-变形细菌DNA的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第一步中步骤(1)所述的β-变形细菌标样的复苏方法如下：

将-80℃低温保存的β-变形细菌标样取出，待β-变形细菌标样达到室温后，加入LB液体培养基中，37℃恒温培养24h后，得到复苏的β-变形细菌标样。

3.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第一步中步骤(2)所述的大肠埃希氏菌感受态细胞的制备方法如下：

(a)从固体LB培养基上挑取大肠埃希氏菌的单菌落置于灭菌LB液体培养基中，37℃恒温培养后，获得新鲜大肠埃希氏菌菌液；

(b)将新鲜大肠埃希氏菌菌液在低温下高速离心，去除上清液，然后加入0℃的灭菌的氯化钙溶液，充分混匀，并于散冰中静置30min；于4℃下高速离心5min，去除上清液；在离心管中继续加入灭菌的氯化钙溶液，散冰上轻柔地摇匀，得到大肠埃希氏菌感受态细胞菌液。

4.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第一步中步骤(3)所述的将复苏的β-变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养的具体方法如下：

(a)大肠埃希氏菌感受态细胞菌液中加入复苏的β-变形细菌标样，冰水浴30min后，40～45℃水浴热激80～90s，再冰水浴2min后加入到LB液体培养基中，混匀后37℃恒温复苏1h，得到复苏浑浊液；

(b)将复苏浑浊液离心，去除上清液，然后涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置LB固体培养基培养12～16h，得到β-变形细菌转化入大肠埃希氏菌后的新鲜β-变形细菌菌落产物；

(c)挑选新鲜β-变形细菌菌落产物中的单个菌落加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养14～16h。

5.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第三步中步骤(1)所述的PCR反应体系共25μl，包括12.5μl市售的SYBR Green Realtime PCR Master Mix、0.5μl正向引物、0.5μl反向引物、10μl灭菌去离子水及1.5μl模板DNA，所述的模板DNA为β-变形细菌质粒稀释液或预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品。