[发明专利]一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌检测方法，尤其是涉及一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法。

背景技术

在水处理及管道输送领域，微生物指标是水质监测的重要组成部分。目前的微生物检测主要集中在水中的悬浮细菌，但实际上，在水处理各工艺及管网中都有生物膜的形成，成为水质稳定的隐患。给水系统中生物膜的形成，主要经由以下5个过程：(1)残留细菌附着；(2)形成微生物群落，产生胞外聚合物；(3)群落自由扩展，形成稳定结构；(4)生物膜成熟，新菌种进入生物膜生长，有机和无机物质被结合，形成溶液梯度，导致生物膜空间的异相结构；(5)成熟的生物膜脱落。以上循环交替重复进行。

变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多病原菌，如大肠埃希氏菌、沙门氏菌、孤菌、螺杆菌等，变形细菌均为革兰氏阴性菌。根据rRNA的不同，变形菌通常分为5类用希腊字母α、β、γ、δ和ε命名。在给水系统中，变形细菌占有主导性。无论作为共生体还是病原体，变形细菌均与真核生物有着密切的交互作用。β-变形菌包括很多好氧或兼性细菌，通常其降解能力可变，但也有一些无机化能种类和光合种类，很多种类可以在废水或土壤的环境样品中发现。该纲的致病菌有奈氏球菌目(Neisseriales)和伯克氏菌属(Burkholderia)。

目前，国内对水处理工艺及管网生物膜生长和结构的研究较少，并且方法大多停留在细菌学指标阶段，较多采用传统纯培养技术来检测分析微生物，对于大多数微生物的样本，微生物形态学仅能提供极少的线索。再者，基于培养的微生物检测技术由于存在高度的选择性和费时、费力等缺点，不能满足分析微生物群落的结构与功能关系的需要。除此之外，许多有机体是不可培养的，生态系统中微生物多样性难以被确定；传统的分离计数技术也难以满足对微生物群落结构变化进行动态监测的要求。对于微生物的深入研究，迫切需要更为准确、全面、灵敏的分析技术。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种准备、灵敏的生物膜β-变形细菌的定量检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，该方法包括以下步骤：

第一步、标准品β-变形细菌的预处理：

(1)将冷冻的β-变形细菌标样放入LB液体培养基中，37℃恒温培养，得到复苏的β-变形细菌标样；

(2)大肠埃希氏菌感受态细胞的制备；

(3)将复苏的β-变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养；

(4)通过质粒抽提试剂盒对步骤(3)所得物进行质粒提取，得到β-变形细菌质粒原液；

(5)利用超微量核酸蛋白测定仪测定步骤(4)所得的β-变形细菌质粒原液的DNA含量；

第二步、待测生物膜β-变形细菌样品的预处理：

(1)将从水处理工艺或管道内壁采集的生物膜样品加入灭菌生理盐水中，经超声预处理，利用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；

(2)提取完毕后，直接采用0.7％的琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳鉴定提取的DNA；

第三步、实时荧光定量PCR检测：

(1)标准品β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：

根据β-变形细菌质粒原液的DNA含量，将β-变形细菌质粒原液分别稀释成DNA含量为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μl的β-变形细菌质粒稀释液，根据PCR反应体系测定对应的β-变形细菌质粒稀释液的循环阈值；

根据检测结果得到β-变形细菌的循环阈值与DNA含量的对应关系，制作标准曲线方程y＝-ax+b，其中，y为循环阈值，x为DNA浓度以10为底的对数；

(2)待测生物膜β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：

根据PCR反应体系测定预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品的循环阈值，根据标准曲线得到样品中β-变形细菌DNA的浓度。

第一步中步骤(1)所述的β-变形细菌标样的复苏方法如下：

将-80℃低温保存的β-变形细菌标样取出，待β-变形细菌标样达到室温后，加入LB液体培养基中，37℃恒温培养24h后，得到复苏的β-变形细菌标样。

第一步中步骤(2)所述的大肠埃希氏菌感受态细胞的制备方法如下：