[发明专利]水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法

权利要求书

1.一种水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，其特点是，按照以下步骤具体实施：

步骤1、制备细菌菌株、质粒，设置培养条件

制备水稻白叶枯Xoo菌株PXO99^A，大肠杆菌Escherichia coli DH5α、S17-1和S17-1λpir；构建pKCxard和pUxard两个质粒，其中的pKCxard是载体pKNOCK-Cm带有xard基因中254bp片段；其中的pUxard是指载体pUFR034带有整个642bp的xard基因，两个质粒的培养条件与文献中描述相同；

步骤2、进行xard基因的克隆和测序

根据Xoo菌株KACC10331基因组序列，设计特异性引物Pxard-1和Pxard-2；以Xoo菌株PXO99^A基因组DNA为摸板，PCR扩增得到产物，纯化后连接到载体pMD18-T并测序；

步骤3、进行xard基因突变和互补实验

xard基因中254bp片段通过引物PMxard-1和PMxard-2扩增得到，克隆到载体pKNOCK-Cm中得到pKCxard；通过标准的操作方法得到S17-1λpir/pKCxard；同样的方法得到xard基因的突变体；

利用引物Pxard-1和Pxard-2检测xard基因和“双拷贝”片段，利用另一对引物Pcat-1和Pcat-2来检测氯霉素抗性基因；

将野生型菌株中xard基因克隆到载体pUFR034中得到pUxard，再将pUxard转化到S17-1中，利用两亲交配方法转入xard突变体中，进行功能互补实验；

步骤4、进行硫源利用的测试；

步骤5、进行剪叶接种实验

将菌株PXO99^A、Mxard3和Mxard3/pUxard培养到终浓度为10⁸CFU/ml，对温室中21天IR24水稻品种的叶片剪叶接种该三个菌株；15天后量取病斑，得到叶片病斑平均值。

2.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，其特点是：所述的步骤1中，制备细菌菌株、质粒过程参照表1，

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3.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，其特点是：所述的步骤2中，设计特异性引物参照

表2，

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4.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，其特点是：所述的步骤2中，序列比对使用DNAStar软件。

5.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，其特点是：所述的步骤4中，L-甲硫氨酸和甲硫基酰苷均采用sigma公司生产的成品材料。

6.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，其特点是：所述的步骤5中，15天后量取病斑，得到五张叶片病斑平均值，实验重复三次。