[发明专利]水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法。

背景技术

甲硫氨酸急救途径（the methionine salvage pathway,MSP）广泛存在于真核和原核生物中错误！未找到引用源。。酸性还原酮加双氧酶（E2）催化很多原核和真核生物中的甲硫氨酸急救途径（MSP）倒数第二步。目前研究该酶的代表性生物主要是酵母，但很多物种中该酶并没有被鉴定和验证。

MSP是甲硫氨酸再循环途径，调节一些重要代谢物，其中包括S-腺苷酰甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,简称SAM或AdoMet）和甲硫基腺苷（methylthioadenosine,简称MTA）。SAM由甲硫氨酸合成，提供不同的基团生成其它代谢产物，调节甲基化或者基因表达错误！未找到引用源。。SAM合成多氨过程中生成MTA，MTA是多氨合成和转甲基反应的抑制子错误！未找到引用源。。多氨是细胞生长和增殖所必需的错误！未找到引用源。。因此，细胞内MTA浓度必须得通过MSP严格控制。

酸性还原酮加双氧酶（ARD）催化MSP倒数第二步错误！未找到引用源。。克雷伯氏菌属（Klebsiella）菌株8724中一种形式的酸性还原酮加双氧酶(FeARD′)含有一个二价铁离子（Fe²⁺），转变1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基-1-戊烯

（1,2-dihydroxy-3-oxo-5-(methylthio)pent-1-ene，酸性还原酮)生成甲酸盐和2-酮-4-甲硫基丁酸盐（2-keto-4-methylthiobutyrate，KMTB)。KMTB是MSP中甲硫氨酸的前体。8724菌株中另一种形式的酸性还原酮加双氧酶(NiARD)含有一个二价镍离子Ni²⁺，催化与FeARD′相同底物的氧化支路生成一氧化碳、甲酸盐和甲硫基丙酮酸盐（methylthiopropionate）错误！未找到引用源。。这两种形式的酶多肽序列相同，且都是称为cupins的结构超家族成员错误！未找到引用源。，唯一的不同之处是含有不一样的金属离子错误！未找到引用源。。FeARD′和NiARD中与铁离子和镍离子作用的四个残基也相同，分别是His96,His98,Glu102和His140错误！未找到引用源。。NiARD催化的反应生成产物之前形成一个四个原子的过氧化物环，而FeARD′催化的反应生成产物前形成一个五个原子的过氧化物环错误！未找到引用源。。这两个酶的活性在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中都已被证实错误！未找到引用源。。

真核生物ARD的同源物表现出除ARD活性以外许多不同的作用错误！未找到引用源。。人类的ARD同源物——MTCBP1（membrane-type1matrix metalloproteinase cytoplasmic tail binding protein-1，也被称为hADI1），在酵母中被证实有ARD活性错误！未找到引用源。。过表达MTCBP1抑制由MT1-MMP(membrane-type1 matrix metalloproteinase)促进的细胞移动和侵入错误！未找到引用源。。老鼠中ARD同源物——ALP1（ARD-like protein1），有促进凋亡的活性并且被雄性荷尔蒙强烈诱导错误！未找到引用源。。MTCBP1和ALP1分别在人肿瘤细胞和鼠前列腺肿瘤细胞中表达下调错误！未找到引用源。。hADI1很可能在信使RNA(mRNA)加工过程中起作用错误！未找到引用源。。

水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)推测的MSP中已经鉴定了稀醇化酶-磷酸酯酶xep(Xanthomonas enolase-phosphatase)基因错误！未找到引用源。。但Xoo推测的MSP中其它基因的功能还没有被证实，这些基因对Xoo在水稻上致病性有没有影响，影响程度有多大均不明确。

发明内容

本发明的目的是，提供了一种水稻白叶枯病菌中的酸性还原酮加双氧酶的鉴定方法，用于克隆和鉴定水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae）中的酸性还原酮加双氧酶E2，填补了水稻白叶枯病菌甲硫氨酸急救途径中所涉及的酶的一个空白。