[发明专利]一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法及其在抗前列腺癌中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种菲律宾蛤仔寡肽，尤其涉及这种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法及其在抗前列腺癌领域中的应用。

背景技术

菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）属软体动物门双壳纲帘蛤目帘蛤科，一种广温性的小型双壳贝类，南方俗称花蛤，与牡蛎、缢蛏、蚶类并列为我国四大养殖贝类，是近岸滩涂和浅海的主要贝类之一，其味道鲜美，营养丰富，蛋白含量高。

研究表明，菲律宾蛤仔提取物具有很多生理功效，如抗肿瘤、抗氧化、抑菌和增强免疫力等，近年来对菲律宾蛤仔提取物的抗肿瘤研究有很大进展，如范秀萍等（食品工业科技，2003）利用菲律宾蛤仔糖胺聚糖的粗制品（CRG）作用于体外培养的HL-60细胞，发现CRG在1.0mg/ml浓度下对HL-60细胞具有显著抑制作用，在24h、48h、72h抑瘤率分别可达59.8%、67.7%和96.2%。张莉等（海洋与湖沼，2007）利用菲律宾蛤仔肉提取两种蛋白聚糖PG1和PG2，其中PG1在200ug/ml浓度时对人肝癌细胞SMMC7721的生长抑制率达到73.30%，且不影响人正常肝细胞HL-7002的生长与功能。前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家由前列腺癌导致的死亡人数占恶性肿瘤引起死亡人数的第二位，仅次于肺癌。近年来随着人民平均寿命的延长和诊断技术的提高，我国前列腺癌的发病率呈显著增长的趋势，已经严重影响着我国50岁以上男性的生活质量和寿命，成为泌尿外科领域一个越来越重要的研究课题，但关于菲律宾蛤仔活性提取物对前列腺癌癌细胞抑制作用的报道较少，且关于菲律宾蛤仔活性肽的抗前列腺癌上的应用的更少。

目前，生物活性肽的制备主要有三种方式：一是从自然界的生物体中提取其本身固有的各种天然活性肽类物质；二是通过蛋白质降解的途径获得具有各种生理功能的生物活性物质；三是利用生物合成的方法来制备生物活性肽。其中，第一种方式中自然界生物体重活性肽类物质的含量较低，提取过程中产率较低，且需要较多的原料个体，使得成本较高；第三种方式中生物合成的过程复杂难控，中间产物较多，不适合大规模产生；综合而言，由于蛋白酶的酶解特异性和高效性，使得酶解法制取生物活性肽的方法安全性高，产率高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种利用蛋白酶酶解法制备菲律宾蛤仔寡肽的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该种菲律宾蛤仔寡肽在抗前列腺癌中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

①将菲律宾蛤仔洗净，取肉后加超纯水搅拌，然后去杂质匀浆，制得匀浆样品；

②取适量的所述匀浆样品，加入适量体积的超纯水，此时原料与超纯水的比值为1:1～1:4，加入蛋白酶在水浴箱中进行酶解反应，其中加酶量为300ug～1500ug,酶解反应的pH值为8～9，酶解时间为4h～12h，酶解温度为40℃～60℃；

③酶解反应结束后灭活、离心、取上清液备用；

④将所述上清液加入超滤膜中进行超滤，收集分子量小于3KDa的酶解物质进行冷冻干燥备用；

⑤利用DEAE SepharoseFF阴离子交换，采用磷酸缓冲液和NaCl溶液对所得酶解液进行阶段洗脱，在280nm波长处收集最高肽峰冷冻干燥后贮存备用；

⑥将DEAE SepharoseFF阴离子交换收集的最高肽峰利用反相高效液相色谱法进行进一步纯化，在220nm波长处出现唯一峰，收集该峰，冷冻干燥制得所述菲律宾蛤仔寡肽。

作为优选，所述原料与超纯水的比值为1:2，这样可使原料在水溶液中充分分离，在不过分稀释蛋白酶浓度的前提下，增加了蛋白酶与酶解对象的接触面积，提高了酶解效率，同时也可保证原料的生物活性。

所述蛋白酶可有多种选择，作为优选，所述蛋白酶为胰蛋白酶，且蛋白酶的最佳酶解条件组合为：加酶量为1200ug，酶解pH值为8.0，酶解时间为8h，酶解温度为50℃。

作为优选，所述步骤③中为沸水浴中灭活15min，4℃下10000r/min离心15min，沸水浴即100℃可使蛋白酶充分灭活，且4℃下高速离心可保证酶解液中相关物质的生物活性。

所述步骤⑤中NaCl溶液的浓度为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L三种，可对酶解液分阶段进行充分洗脱。