[发明专利]精氨酸脱亚氨基酶基因工程菌的构建及其用途

说明书

技术领域

本发明属于工业生物技术和医药领域，涉及一种基于精氨酸脱亚氨基酶的重组酶、工程菌及其在瓜氨酸生产中的用途。

技术背景

 精氨酸脱亚氨酶(Arginine desiminase, ADI)是一种能够分解精氨酸的蛋白质。该酶首先被应用于工业生产一步转化精氨酸制备瓜氨酸(Applied Microbiology,1971:992-999)，也是目前被应用最广泛的瓜氨酸生产方法之一。1978年日本学者自恶臭假单胞菌纯化了并研究了该酶的性质，发现该酶具有较高以精氨酸为底物合成瓜氨酸的活性(FEBS Letters,1978,96(2):389-391)。随后，该酶被确定为微生物精氨酸代谢过程ADI代谢途径的关键酶(Gene,1990,87:37-43)。

在医学领域,学者在被支原体污染的表皮细胞中发现ADI能够抑制细胞生长(Biochemical and Biophysical Research Communications，1999,261:10-14)，是一种细胞生长的抑制剂。进一步的研究发现ADI对人的肿瘤细胞，如肝细胞癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞的增殖亦有明显的抑制作用(International Journal of Cancer,1992,51(2):244-249; Leukemia,2000,14(5):826-829)。国外已经把ADI及其修饰物作为一种新型抗癌药进行研究，用于治疗肝脏肉瘤、黑色素瘤等肿瘤(Expert Opinion on Investigational Drugs, 2006,15(7):815-822; British Journal of Cancer,2003,89(5):907-914)。

本专利在未经微生物纯培养的方式下，通过对环境微生物基因组的研究，克隆并表达了两条精氨酸脱亚氨酶基因SEQ ID No.1和SEQ ID No.3，相关微生物菌种于2013年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会（地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏号分别为CGMCC No.7491和CGMCC No.7492，菌种分类均为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），为L-瓜氨酸工业化生产和医药学研究提供了新的途径和基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供，一种利用精氨酸脱亚氨基酶或者含有该酶的工程菌进行生物转化获取瓜氨酸的新途径。

本发明的技术方案如下：

实现上述目的的基本技术路线为：

总体技术方案是克隆包括ADI的编码基因，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建转化载体，将ADI基因克隆到合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、酵母、CHO细胞、昆虫细胞等。

1.基因模板的提取 将待克隆精氨酸脱亚氨基酶的菌群在精氨酸富集培养基上室温过夜富集培养，至合适菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取群落菌体DNA作为基因获取的模板。

2. 精氨酸脱亚氨基酶基因的克隆  根据Pseudomonas putida ATCC 4359(Genbank登录号: U07185) 保守序列，设计带有酶切位点的引物，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法，通过PCR扩增精氨酸脱亚氨基酶基因。

3.转化载体的构建、转化和阳性克隆的筛选 按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可以从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目的基因克隆至载体，转化宿主细胞，并实现阳性克隆筛选。

发明效果

 利用本技术方案涉及的方法，构建了基于精氨酸脱亚氨基酶实现以精氨酸为底物生产瓜氨酸的微生物细胞模型，进行了阳性筛选，并进行了生物转化。

附图说明

 图1 PCR产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。1,2,3：以环境DNA样品为模板的ADI基因PCR扩增产物，M：分子量标记(DL2000)。

图2表达载体Nde I和Hind III双酶切分析(0.8%琼脂糖凝胶电泳) 。 1：pET- KSRD3-1（SEQ ID No.1）， 2：pET- KSRD3-2（SEQ ID No.3），M：分子量标记(DL10000)。