[发明专利]一种借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测病毒的引物及应用，尤其是一种检测禽流感病毒的引物及应用，属于医学技术领域。

背景技术

自2013年2月以来，上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例。患者病情发展迅速，多在5-7天出现重症肺炎可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、感染性休克，甚至多器官功能障碍，病死率极高。病原学研究表明其病原体为人感染H7N9亚型禽流感病毒。不同于禽类中流行的H7N9亚型病毒，人感染H7N9亚型禽流感病毒基因组内部发生了重配，使其获得了感染人的属性。这也是H7N9亚型禽流感病毒感染人的首次报道。

由于该病病情凶险，进程快，对该病的早发现、早诊断已经成为提高治愈率，降低病死率的关键。而针对人感染H7N9亚型禽流感病毒的病原学检测是该病早发现和早诊断主要依据。目前，禽流感病毒的主要检测方法包括病毒分离、病毒抗原和基因检测以及血清学检查三个方面。其中，病毒分离耗时长，技术要求高，不利于快速诊断；血清学检查只能用于回顾性诊断；病毒抗原检测耗时、费力；在病毒基因检测方面，WHO推荐的禽流感H7N9实时荧光定量PCR检测体系，目前已经成为人感染H7N9亚型禽流感病原学检测的主要方法。采用实时荧光定量PCR的方法检测禽流感可以做到高通量、快速准确，但是，该系统需要特殊仪器，且检测成本较高，不适宜在基层医疗卫生单位开展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提出一种借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物及应用，可快速检测人感染H7N9亚型禽流感病毒。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物，包括简并引物和环引物，所述简并引物和环引物是依据现有核酸数据库中人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段序列和N9基因节段序列分别进行同源性比对，根据保守序列，针对各基因设计而得，所述H7基因简并引物的序列为：

H7-F3TGTCTGTTATCCTGGGAAAT

H7-B3AGCATTATCTGTGTTTGACAG

H7-FIP GTATGTGAATCCCATTGCTTCCTTGGTGAATGAAGAAGCTCTGAGG

H7-BIP GGAATAAGAACTAATGGARCAACCAAGCCATTTCATTTCTGCATAG；

所述H7基因环引物的序列为：

H7-LF CCGCCTGATTCTCTGAGWATTT

H7-LB GCATGTAGGAGATCAGGATCTTCA；

所述N9基因简并引物的序列为：

N9-F3CGAGGTCTGGATACGAGA

N9-B3TTATCYTCCTTGGGTCTTCC

N9-FIP AGCGTTTARTACAATTGTCTGACCTTTAAAAGTGCCAAATGCATTGA

N9-BIP CTGGAGTGGTTACAGTGGATCTYTCCACATAAAAACACGCTC；

所述N9基因环引物的序列为：

N9-LF TGAATGGGCTTTGATCTATCATCTG

N9-LB TGGACTATTGGGCTGARGGGGAC。

本发明借助RT-LAMP检测人感染H7N9亚型禽流感病毒的引物的应用，包括以下步骤：

步骤一：针对人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段和N9基因节段序列，设计并合成包含T7启动子的引物,对扩增的目的基因片段进行体外转录，转录产物纯化和定量后，将其稀释为10⁶-10⁰拷贝/μl，即得人感染H7N9亚型禽流感病毒的H7基因节段和N9基因节段的标准RNA模板，作为对照，用于比较本发明方法的敏感性；

步骤二：将人感染H7N9亚型禽流感病毒的HA和NA基因分别进行H7亚型RT-LAMP反应和N9亚型RT-LAMP反应，在所述RT-LAMP反应体系中加入目测荧光染料，于反应结束后依据目测结果进行结果判读。

进一步地，所述步骤一中，H7基因T7启动子引物的序列为：

HA:CCTGGTATTCGCTCTGATTGC