[发明专利]一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂及其制备、使用方法

权利要求书

1.一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂，包括单抗和多抗,其特征在于，单抗为小反刍兽疫单抗；多抗为小反刍兽疫多抗；该检测试剂还包括：稀释液、HRP羊抗鼠二抗、小反刍兽疫病毒阳性对照、小反刍兽疫病毒阴性对照、20倍浓缩洗涤液、底物液、终止液、酶联免疫吸附板。

2.根据权利要求1所述的一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂，其特征在于，所述的稀释液配方为含有质量分数为0.5%～3%的BSA和质量分数为0.05%～1.0%Tween-20的PBS。

3.根据权利要求1所述的一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂，其特征在于，所述的20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含有质量分数为0.05%～1.0%Tween-20的0.01mol/LpH7.0～7.5的PBS。

4.根据权利要求1所述的一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂，其特征在于，所述的终止液为1mol/L～2mol/L H₂SO₄溶液。

5.根据权利要求1所述的一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂，其特征在于，所述的酶链免疫吸附板为高分子吸附板。

6.如权利要求1所述的一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂的制备方法，其特征在于，所述小反刍兽疫单抗制备方法包括：使用纯化的小反刍兽疫病毒免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得的小反刍兽疫单抗。

7.如权利要求1所述的一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂的制备方法，其特征在于，所述小反刍兽疫多抗通过以下方法制备：利用商品化的小反刍兽疫疫苗加等体积弗氏完全佐剂乳化和弗氏不完全佐剂免疫18月龄山羊，分离血清；依次用硫酸铵、ProteinG柱进行纯化制备的小反刍兽疫多抗。

8.如权利要求1所述的一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂的使用方法，其特征在于，操作步骤为，

1）试剂工作液的配置：

PBST洗液：利用提供的20倍浓缩洗涤液，洗液中如出现沉淀，请37℃加热使其溶解，用去离子水或蒸馏水进行20倍稀释，即为PBST洗液；

PPRV多抗原液：在PPRV多抗冻干瓶中加入500μL去离子水，混匀，即为PPRV多抗原液，-20℃保存；

PPRV多抗工作液：用包被液1:50稀释PPRV多抗原液，即为PPRV多抗工作液；

PPRV单抗工作液：用提供的稀释液按1:50稀释，即为PPRV单抗工作液；

HRP羊抗鼠二抗工作液：用提供的稀释液进行1:100稀释HRP羊抗鼠二抗，即为HRP羊抗鼠二抗工作液；

PPRV阳性对照：在PPRV阳性对照冻干瓶中加入0.75mL去离子水，混匀，即为PPRV阳性对照工作液，-20℃保存；

PPRV阴性对照：在PPRV阴性对照冻干瓶中加入0.75mL去离子水，混匀，即为PPRV阴性对照工作液，-20℃保存；

2）操作步骤：

计算测试样品数量，取所需测试ELISA板条，进行试验；

（1）ELISA板每孔加入100μL PPRV多抗工作液，37℃连续震荡作用1h或4℃连续震荡包被过夜；

（2）用PBST洗液，每孔加300μL，洗板3次，甩干；

（3）每孔分别加入：

a：加50μL稀释液到A1，A2，B1，B2孔；

b：加50μL阳性对照到C1，C2，D1，D2孔；

c：加50μL阴性对照到E1，E2，F1，F2孔；

d：加50μL样品到测试孔中，每样作一个重复；

e：每孔加入50μL PPRV单抗工作液；

37℃连续震荡反应1h；

（4）用PBST洗液，每孔加300μL，洗板3次，甩干；

（5）每孔加入HRP羊抗鼠二抗工作液100μL，37℃连续震荡反应1h；

（6）用PBST洗液，每孔加300μL，洗板3次，甩干；

（7）每孔加入底物液100μL，37℃避光静置10min～15min；

（8）加终止液100μL，在15min之内，用ELISA仪，在450nm波长下读数；

3）结果判定：

（1）计算公式：

PP=样品孔平均OD值/阳性对照孔平均OD值×100

（2）判定标准：

PP结果≥12阳性＜12阴性

注：每份样品加样两孔，在结果判定时如出现1孔PP值大于等于12，1孔PP值小于12时，需重复检测；

4）结果判定成立条件

检测结果在下列条件同时成立时进行检测结果判定

（1）PPRV阳性对照，OD值大于12；

（2）PPRV阴性对照，PP值小于12；

（3）CC：HRP羊抗鼠二抗对照，孔PP值小于12。