[发明专利]一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂及其制备、使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其制备方法。

背景技术

小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）对绵羊和山羊的发病率和死亡率分别高达100%和90%，在发展中国家引起严重的社会经济问题，被世界动物卫生组织（OIE）列为重要动物疾病。该病首次报道在科特迪瓦，现发生在撒哈拉以南和赤道以北的多数非洲国家，中东到土耳其的几乎全部国家，在印度、南亚、西亚也广泛传播。2007年7月，该疫病首次传入我国西藏地区。

小反刍兽疫病毒检测方法，世界动物卫生组织推荐使用的方法为琼脂凝胶免疫扩散试验、捕获酶联免疫吸附试验、核酸检测、对流免疫电泳、组织培养和病毒分离方法等。其中由于捕获ELISA法或夹心ELISA法，实验环境要求低，能同时进行大量样品的检测，因此在上述检测方法中尤为重要。

小反刍兽疫病毒夹心ELISA检测试剂盒，国内尚未见商品化的相关产品。在国际上与之检测原理相关的为法国BIRAD实验室研制的小反刍兽疫病毒捕获ELISA试剂盒（Libeau.et al.,1994）。本专利研制的夹心ELISA检测方法，区别于OIE推介的捕获ELISA检测方法，但其检测灵敏性、特异性等指标均与捕获ELISA检测方法相同。参考文献：G.Libeau,A.Diallo,F.Colas,et al.Rapid differential diagnosis of rinderpest and peste des petits ruminants using an immunocapture ELISA.1994,300-304）。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，利用免疫山羊制备小反刍兽疫多抗；研制针对小反刍兽疫核蛋白的特异性单抗；组装的试剂盒，检测指标达到国际认可的检测值。

本发明采用如下技术方案实现。

一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂，包括单抗和多抗,本发明单抗为小反刍兽疫单抗；多抗为小反刍兽疫多抗；该检测试剂还包括：稀释液、HRP羊抗鼠二抗、小反刍兽疫病毒阳性对照、小反刍兽疫病毒阴性对照、20倍浓缩洗涤液、底物液、终止液、酶联免疫吸附板。

本发明所述的稀释液配方为含有质量分数为0.5%～3%的BSA和质量分数为0.05%～1.0%Tween-20的PBS。

本发明所述的20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含有质量分数为0.05%～1.0%Tween-20的0.01mol/L pH7.0～7.5的PBS。

本发明所述的终止液为1mol/L～2mol/L H₂SO₄溶液。

本发明所述的酶链免疫吸附板为高分子吸附板。

一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂的制备方法，本发明小反刍兽疫单抗制备方法包括：使用纯化的小反刍兽疫病毒免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得的小反刍兽疫单抗。筛选过程为将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得杂交瘤细胞株5B11，取杂交瘤细胞，注射小鼠腹腔，制备腹水，利用ProteinG柱纯化的5B11单抗。

本发明所述小反刍兽疫多抗通过以下方法制备：利用商品化的小反刍兽疫疫苗加等体积弗氏完全佐剂（FCA）乳化和弗氏不完全佐剂（FIA）免疫18月龄山羊，分离血清；依次用硫酸铵（SAS）、ProteinG柱进行纯化制备的小反刍兽疫多抗。

一种检测小反刍兽疫病毒的夹心ELISA检测试剂的使用方法，其操作步骤为，

1）试剂工作液的配置：

PBST洗液：利用提供的20倍浓缩洗涤液，洗液中如出现沉淀，请37℃加热使其溶解，用去离子水或蒸馏水进行20倍稀释，即为PBST洗液；

PPRV多抗原液：在PPRV多抗冻干瓶中加入500μL去离子水，混匀，即为PPRV多抗原液，-20℃保存；

PPRV多抗工作液：用包被液1:50稀释PPRV多抗原液（如：10μL多克隆抗体原液+490μL包被液），即为PPRV多抗工作液；

PPRV单抗工作液：用提供的稀释液按1:50稀释，即为PPRV单抗工作液；

HRP羊抗鼠二抗工作液：用提供的稀释液进行1:100稀释HRP羊抗鼠二抗，即为HRP羊抗鼠二抗工作液；