[发明专利]一种鉴别金银花和山银花的PCR-RFLP方法

说明书

技术领域

本发明属于中药材种质鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别金银花和山银花的PCR-RFLP方法。

背景技术

2010年版《中华人民共和国药典》上记载金银花即忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.）、红腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、华南忍冬（Lonicera confusa DC.）和黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng.）干燥花蕾或带初开的花。金银花与山银花在植物形态和药材形状上非常相似，较难分别。但金银花和山银花的药效和药性却存在明显区别：金银花含绿原酸和木犀草苷，性凉，清热解毒、疏风散热功效佳；而山银花含绿原酸但木犀草苷微乎其微，性偏热，药效欠佳。金银花由于产量低、管理成本高、市场需求大，所以价格贵，而山银花产量大、易于采摘、便于管理，价格低。山银花虽药效欠佳，但与金银花的市场价格相差1/3以上，很多不良商贩用山银花冒充金银花。所以建立一种快速有效的鉴定金银花与山银花药材的方法非常有必要。传统的形态鉴别和成分分析，很难鉴定掺杂在金银花中的山银花，形态鉴别主观性强，成分分析实验操作复杂、结果稳定性欠佳。PCR-RFLP用于近缘种的鉴别已有许多成功范例，具有快速、简单、准确等优点。但这种鉴别对不同的物种，所用的引物、限制性内切酶的种类及鉴别方法都不相同。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别金银花和山银花的PCR-RFLP方法，包括金银花的特征碱基DNA序列内的一种限制性内切酶位点及与山银花的区别。

本发明提出的鉴别金银花和山银花的PCR-RFLP方法，首先从金银花及山银花药材样品中提取总DNA，利用一对引物进行PCR扩增一段DNA片段，经纯化后对该DNA片段进行测序，建立各样品的DNA数据库，利用生物信息学软件Mega5.0进行序列比对，找出金银花与山银花的差异位点，利用软件DNAman进行限制性酶切位点分析，选择合适的DNA限制性内切酶，达到快速、准确鉴别金银花和山银花的目的。对需要鉴定的供试样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物（Y1、Y2）扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶CfrⅠ或其同切酶EaeⅠ对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，若只有一条722bp的条带则供试样品为山银花，若有196bp和526bp两条带则供试样品为金银花。具体步骤如下：

(1)从金银花及山银花药材样品中提取DNA，利用改良CTAB法，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.1~0.3μg/μl；

(2)通过一对引物，利用聚合酶链式反应（PCR），扩增步骤(1)得到的一段DNA，其中：用于PCR的一对引物的DNA序列为：

Y1：5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’

Y2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

(3)对步骤(2)得到的PCR产物中加入限制性内切酶CfrⅠ或其同切酶EaeⅠ，进行酶切，限制性内切酶CfrⅠ或其同切酶EaeⅠ的酶切位点为：Y^∧GGCCR；

(4)琼脂糖凝胶电泳分析；

(5)鉴定结果的判断：若只有一条722bp的条带则供试样品为山银花，若有196bp和526bp两条带则供试样品为金银花。

本发明中，步骤(2)中所述扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃ 1 min，50℃ 2min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10 min。

本发明的效果是：可解决金银花与山银花药材的鉴别问题，提供鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、一种限制性内切酶。与山银花相比，金银花药效更佳、需求量大、供不应求，市场价格高出1/3以上。然而，金银花与山银花药材外形非常相似，难以通过形态、显微等特征进行快速、准确鉴别。本发明利用金银花与山银花DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鉴别方法，对于保证金银花的药材质量，打击用山银花冒充金银花的不良行为，保护消费者权益具有重要的价值。

附图说明