[发明专利]一种棒状杆菌基因连续敲除系统及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种棒状杆菌基因连续敲除系统，其特征在于包括模板质粒及温敏表达质粒；所述模板质粒提供两端带有loxp或变异loxL/R位点的kan片段，又称kan盒；所述温敏表达质粒携带Cm抗性基因cat及温敏C.glutamicum复制子，表达Cre重组酶，用于去除Km抗性基因kan。

2.权利要求1所述的敲除系统，其特征在于所述模板质粒为pDTW201/202。

3.权利要求1所述的敲除系统，其特征在于所述温敏表达质粒为pDTW109。

4.权利要求1-3任一所述敲除系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步：以pK18mobsacB为模板，PCR扩增得到kan基因，并在其两端分别引入XhoI和XbaI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；将人工合成的loxp片段loxp-F-F/loxp-F-R和loxp-R-F/loxp-R-R分别退火，形成双链，备用；将人工合成的loxL/R片段loxL-F/loxL-R和loxR-F/loxR-R分别退火，形成双链，备用;

第二步：将第一步处理好的kan片段、loxp片段和经过ApaI和SacII酶切纯化的pBluescript II SK(+)质粒连接，转化JM109，新质粒命名为pDTW201；以loxL和loxR片段代替两段loxp片段，依照pDTW201的构建方法，构建的kan盒模板质粒命名为pDTW202；

第三步：以pACYC184为模板，以相应引物扩增氯霉素酰基转移酶Cat可移阅读框，并在扩增片段的5′和3′末端引入NheI和HindIII酶切位点；片段经过NheI和HindIII酶切纯化后与经过同样处理的pDXW-10连接形成pDXW-10-cat，转化大肠杆菌；以E.coli质粒pKK223-3为模板，以相应引物扩增E.coli复制子oriE，片段5′和3′末端均引入SmaI限制性内切酶切点；以pDXW-10-cat为模板，以相应引物扩增氯霉素抗性基因，片段5′和3′末端引入SmaI切点；两个片段均经过SmaI酶切纯化后连接，转化JM109，新质粒定名为pDTW-101；将质粒pDTW-101和人工合成的MCS用HindIII和NheI酶切后纯化，连接，转化JM109；新的质粒定名为pDTW102；

第四步：以含有C.glutamicum pBL1复制子的pC2质粒作为模板，以相应引物扩增C.glutamicum复制子rep，并在扩增片段的5′和3′末端引入HindIII和SacII酶切位点；片段经过HindIII和SacII酶切纯化后与经过同样处理的pDTW102连接，转化JM109，新的质粒定名为pDTW104；

第五步：使用相应引物对质粒pDTW104进行点突变，使C.glutamicum/pDTW104具有温敏特性；新的具有温敏特性的质粒定名为pDTW106；

第六步：在pDTW106上再引入一个MCS序列，弥补之前操作导致的酶切位点消耗；使用寡核苷酸链进行退火，与经过SacI和SacII酶切纯化处理的pDTW106连接，转化JM109，新质粒定名为pDTW107；

第七步：引入tac启动子；采用寡核苷酸链进行退火形成双链，与经过BglII和SacII酶切纯化处理的pDTW107连接，转化JM109，新质粒定名为pDTW108；

第八步：以pSH47为模板质粒，以相应引物扩增重组酶片段，片段5′和3′末端引入XhoI和PstI酶切位点；重组酶片段经过XhoI和PstI酶切纯化与经过同样处理的pDTW108质粒进行连接，转化JM109，新质粒定名为pDTW109。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于所述pDTW201所含的kan盒模板核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

6.权利要求4所述的方法，其特征在于所述pDTW202所含kan盒模板核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

7.权利要求4所述的方法，其特征在于所述温敏Cre重组酶表达质粒pDTW109核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.权利要求1-3任一所述的敲除系统在ATCC13869/14067/13032中aceE敲除中的应用。

9.权利要求1-3任一所述的敲除系统在ATCC14067中aceE及ilvA连续敲除中的应用。

10.权利要求8或9任一所述的应用，其特征在于敲除流程为：

（1）将敲除用质粒从E.coli JM109中提取，电转化C.glutamicum菌株，涂布于含有乙酸钾和卡那霉素的固体恢复培养基，30°C培养约36小时；

（2）挑取平板上单菌落进行PCR验证，选取验证正确的单菌落，进行液体培养，制备感受态；

（3）将质粒pDTW109从E.coli JM109中提取，电转化上一步中制备的感受态，涂布于含有乙酸钾和氯霉素的固体恢复培养基，25°C培养约36小时；

（4）挑取平板上单菌落进行质粒验证，选取验证正确的单菌落；

（5）将上一步获得的菌株接种于液体培养基，37°C过夜培养；

（6）将上一步中过夜培养物划线于含乙酸钾的LBG固体培养基，30°C培养约24小时；

（7）挑取平板上单菌落分别进行抗性验证和PCR验证获得敲除成功的目的菌株。