[发明专利]一种棒状杆菌基因连续敲除系统及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种棒状杆菌基因连续敲除系统及其构建方法和应用，特别是一种基于同源重组与特异位点重组相结合的敲除系统，属于微生物基因工程领域。

背景技术

棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，属于具有中度到高GC含量的放线菌。自人们首次分离谷氨酸棒状杆菌生产L-谷氨酸以来（Kinoshita et al.,1985），棒状杆菌的三个主要代表：谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌，和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸。

由于已累计了大量的关于谷氨酸棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识（Eggeling and Bott，2005;Burkovski，2008），代谢工程已经取代经典的随机突变，成为棒状杆菌菌种改良的主要策略。随着谷氨酸棒状杆菌全基因组的测序，基因工程手段在代谢工程育种中地位越来越重要。利用分子生物学手段进行代谢工程育种，首先是需要有合适的载体。目前，随着谷氨酸棒状杆菌内源质粒包括pCG1（Ozaki，1984）、pBL1（Santamaria，1984）等家族的质粒的发现，研究者已经构建出大量用于进行基因表达的质粒（Xu，2010）。但是，另外一类质粒，用于染色体基因修饰的载体却显得很匮乏。目前应用广泛的棒状杆菌敲除载体为pK18mobsacB/pK19mobsacB。但其由于sacB基因的插入失活有时会给第二轮交换筛选带来很大麻烦。当sacB基因处于谷氨酸棒状杆菌亚种C.glutamicum ATCC14067染色体上时，不具有蔗糖敏感性，所以对于C.glutamicum ATCC14067需构建一套合适的敲除系统。

在本发明中，我们首先构建了一种基于同源重组与特异位点重组相结合的敲除系统。同源重组主要是依赖于片段或是载体与目标基因组存在一定相同的同源DNA序列，经过同源区的配对和链断裂、再接产生交换，完成DNA重组。同源重组是最基本的重组方式，可以发生在任何一个菌株中，其中，同源片段越长越利于发生重组。在基因工程中，在抗性基因两侧添加目的基因两侧DNA片段作为同源臂，通过同源重组，目的基因由于两侧同源臂的重组交换而被抗性基因替代。特异位点重组利用Cre/lox特异重组系统。Cre/lox重组系统发现于P1噬菌体，包括重组酶和重组位点两部分，其中，Cre是隶属于λInt酶超基因家族的重组酶，可以接到重组位点间的基因序列被删除或重组；loxp位点是可供Cre重组酶识别作用的重组位点，当两个loxp位点位于一条DNA链上并且方向相同时，Cre重组酶能切除两个loxp位点间的序列。loxL/loxR为突变loxp位点，两个重组位点经过Cre酶重组后，产生一个不能再被Cre重组酶识别的位点loxLR，该位点不再参与位点重组。

本发明构建的敲除系统即利用同源重组及变异loxLR位点,用于扩增两端含有克服现有敲除系统的缺陷，可用于棒状杆菌主要亚种的基因敲除；敲除过程首先通过同源重组以Km抗性基因kan置换目的基因，然后通过位点特异重组去除基因组上抗性基因，操作简便高效；可用于同一菌株中多个基因连续敲除；敲除完成后被改造菌株不携带任何抗性。

发明内容

本发明提供了一种棒状杆菌基因连续敲除系统及其构建方法，通过此敲除系统1）成功敲除棒状杆菌三个代表：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，黄色短杆菌ATCC14067，和乳糖发酵短杆菌ATCC13869中aceE；2）完成黄色短杆菌ATCC14067中aceE及ilvA的连续敲除。

本发明提供的棒状杆菌基因连续敲除系统，包括模板质粒及温敏表达质粒；所述模板质粒提供两端带有loxp或变异loxL/R位点的kan片段，又称kan盒；所述温敏表达质粒携带Cm抗性基因cat及温敏C.glutamicum复制子，表达Cre重组酶，用于去除Km抗性基因kan。所述模板质粒为pDTW201/202；所述温敏表达质粒为pDTW109；其核苷酸序列如SEQ IDNO.1-NO.3所示。

棒状杆菌基因连续敲除系统构建方案为：

第一步：以pK18mobsacB（Schafer et al.,1994）为模板，以kan-F/kan-R引物对作为模板，PCR扩增得到kan基因，并在其两端分别引入XhoI和XbaI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；将人工合成的loxp位点序列loxp-F-F/loxp-F-R和loxp-R-F/loxp-R-R分别退火，形成双链，备用；将人工合成的loxL/R位点序列loxL-F/loxL-R和loxR-F/loxR-R分别退火，形成双链，备用;