[发明专利]一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，包括：

脱氧核酶-底物连接体，包括通过连接序列连接的脱氧核酶和底物，在铅离子催化下脱氧核酶的底物断裂，产生可作为链置换扩增引物的寡聚脱氧核苷酸链；

扩增底物，包括dNTPs混合物；

DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；

触发DNA分子机器工具的SDA模板，与脱氧核酶产生的寡聚核苷酸链杂交后被DNA聚合酶所扩增；

具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；

具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列；

以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。

2.如权利要求1所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，铅离子检测试剂盒，包括10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl₂,1mM dithiothreitol，20nM脱氧核酸，10nM SDA模板，50nM发卡分子H，250nM分子信标，2.5U Klenow fragment聚合酶，4U Nt.BbvCI核酸切口酶，以及0.2mM dNTPs。

3.如权利要求1或2所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，所述的脱氧核酶-底物连接体中，底物部分包括一个核糖核苷酸和能够与SDA模板相识别的寡聚脱氧核苷酸链；

所述的SDA模板包括识别寡聚脱氧核苷酸链的序列、核酸切口酶识别位点和扩增与发卡分子H相识别产物的序列；

所述的发卡分子H包括与SDA模板产物相识别的序列、核酸切口酶识别位点的双链中不被切割的序列和与分子信标相识别的序列；发卡分子H的5’端突出有多个碱基序列，3’端修饰有磷酸基团；

所述的分子信标包括Nt.BbvCI酶的识别位点为5’-CCTCAGC-3’；

所述的DNA分子机器工具由KF聚合酶和Nt.BbvCI核酸切口酶组成。

4.如权利要求1或2所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，其特征在于，所述的SDA模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

发卡分子H的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；

分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。

5.一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将待检测的溶液超滤去除悬浮颗粒；

2）将待检测的溶液与脱氧核酶-底物连接体、扩增底物、DNA分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子H、分子信标探针以及DNA分子机器扩增反应缓冲液混合；

3）脱氧核酶在铅离子存在的情况下，脱氧核酶-底物连接体断裂，产生链置换扩增的寡聚核苷酸链，该寡聚核苷酸链与SDA模板杂交，寡聚核苷酸链3‘端在DNA聚合酶的作用下进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生SDA产物，而寡聚核苷酸链与SDA模板的杂交物继续进行扩增；

4）扩增所获得的SDA产物触发打开发卡分子H构成杂交体，发卡结构H被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的茎环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物与发卡分子H构成的杂交体再打开新的分子信标，以产生更多的荧光信号；

5）待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中铅离子的含量，在一定范围内，铅离子浓度越高，则荧光信号越强。

6.如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，脱氧核酶底物断裂点3’端的序列与SDA模板5’端的DNA序列完全互补。

7.如权利要求5所述的基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测方法，其特征在于，SDA产物与发卡结构有18个bp的互补序列，可以在37℃相互杂交从而打开发卡结构。