[发明专利]一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于铅离子的检测技术领域，涉及一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

铅离子是一种常见的高毒性污染物，会对水生生态系统中的植物和动物产生不良影响。铅污染的主要来源可能是汽油和铅基油漆。对于人类来说，铅离子会带来许多健康问题，如贫血，肾功能故障和肌肉麻痹。即使在低浓度下，铅中毒也会是对儿童大脑和中枢神经系统产生严重的损害。因此发展一种超灵敏和高选择性的铅离子检测方法对临床检测，工业和环境监测都是非常重要。

传统的检测铅离子等重金属的主要方法是色谱法、原子吸收/发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法等，但是这些方法存在很多弊端，比如依赖大型仪器设备，样品预处理过程复杂，需要专业人员操作，以及检测成本较高。近年来，基于脱氧核酶（DNAzyme）的新型铅离子传感检测方法得到了发展，如电化学法，比色法和荧光法。然而比色法虽然结果肉眼可见但是灵敏度不够高，并且纳米金的合成与准备过程也较为繁琐。而电化学法的灵敏度高但是操作复杂，时间较长，需要配备价格较为昂贵的电化学相关仪器，同时，核酶相关的荧光法由于没有进行放大虽然更加快速和简便，但是比较难以获得令人满意的灵敏度和检测范围。

基于链置换扩增（Strand displacement amplification，SDA）的DNA分子机器（DNA-machine）技术利用具有链置换活性的DNA聚合酶的延伸反应与核酸切口酶（nicking enzyme）识别并切割特定双链中单链的性质，能够在恒温条件下迅速扩增出多条寡核苷酸单链。相比于传统扩增技术如PCR，SDA不仅具有较高的扩增效率，而且不需要精确地热循环设备，只需要简易的恒温装置即可。此外，具有链置换活性的DNA聚合酶如KF聚合酶（Klenow fragment polymerase，KF polymerase）等相对于Taq DNA聚合酶受复杂体系影响较小。因此近年来，这类DNA分子机器受到国内外研究学者的广泛关注，被越来越多地用于DNA,microRNA,以及其它生物活性分子的检测信号的放大。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法，通过基于DNA分子机器的恒温级联核酸扩增方法进行铅离子含量的检测，灵敏度高同时操作简便，成本较低。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒，包括：

脱氧核酶-底物连接体，包括通过连接序列连接的脱氧核酶和底物，在铅离子催化下脱氧核酶的底物断裂，产生可作为链置换扩增引物的寡聚脱氧核苷酸链；

扩增底物，包括dNTPs混合物；

DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；

触发DNA分子机器工具的SDA模板，与脱氧核酶产生的寡聚核苷酸链杂交后被DNA聚合酶所扩增；

具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；

具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列；

以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。

所述的铅离子检测试剂盒，包括10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl₂,1mM dithiothreitol，20nM脱氧核酸，10nM SDA模板，50nM发卡分子H，250nM分子信标，2.5U Klenow fragment聚合酶，4U Nt.BbvCI核酸切口酶，以及0.2mM dNTPs。

所述的脱氧核酶-底物连接体中，底物部分包括一个核糖核苷酸和能够与SDA模板相识别的寡聚脱氧核苷酸链；

所述的SDA模板包括识别寡聚脱氧核苷酸链的序列、核酸切口酶识别位点和扩增与发卡分子H相识别产物的序列；

所述的发卡分子H包括与SDA模板产物相识别的序列、核酸切口酶识别位点的双链中不被发生切割的序列和与分子信标相识别的序列；发卡分子H的5’端突出有多个碱基序列，3’端修饰有磷酸基团；

所述的分子信标包括Nt.BbvCI酶的识别位点为5’-CCTCAGC-3’；

所述的DNA分子机器工具由KF聚合酶和Nt.BbvCI核酸切口酶组成。

所述的SDA模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

发卡分子H的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；