[发明专利]蜡样芽孢杆菌的快速分离新方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于纳米磁珠的食源性致病菌分离方法。

背景技术

食源性致病菌污染是我国食品安全的重大问题之一。据WHO统计，发达国家每年约有三分之一的人感染食源性疾病，全世界每年有220万人因患食源性疾病而丧生。在我国，每年食物中毒例数在20～40万人，除意外事故外，大部分均由食源性致病菌引起。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）作为常见的食源性致病菌之一，主要污染肉、牛奶、蔬菜、鱼、大米和面食等，目前已被挪威和荷兰认定为食品中最容易检出的病源微生物，由其引起的中毒事件时有发生，危害人的健康。其引起的主要中毒症状表现为呕吐、腹泻，和其它一些致病菌引起的症状相似，从而常常被忽略。因此，发展快速、高效富集分离样品中蜡样芽孢杆菌的技术极有必要。 

免疫磁分离技术是食源性致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌，提高致病菌检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法（IMS）将目标菌抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标菌进行捕获、富集，磁分离（具体原理见图2A）。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1）微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细菌细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细菌细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在食品基质液中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）传统的免疫磁分离技术，往往是将抗体分子直接偶联于免疫磁珠上，此过程常常会导致抗体的活性大大地降低并且导致抗体的空间方向发生改变增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低了抗体的捕获效率5）食品基质性质复杂并且其中非目的致病菌的杂菌浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对食品样液中目的菌的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成细菌细胞的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败；7）磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种简便、捕获效率高、分离时间短，低梯度磁场下（小于30 T/m）能从复杂的食品基质中快速、特异性分离蜡样芽孢杆菌的方法。

蜡样芽孢杆菌的快速分离新方法，包括以下步骤：（1）取2.8 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取6 mg 蜡样芽孢杆菌特异性抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得多臂井星聚合物-抗体复合物；（2）取15 mg 长链生物素，3.6 mg NHSS，2.4 mg EDC溶解于2 mL PBS（0.02 M，pH 6.5）缓冲液中；加入0.55 mg多臂井星聚合物-抗体复合物，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物；（3）取1 mL待测样品溶液，加入0.1 mg蜡样芽孢杆菌抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物即步骤（2）长链生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，常规磁力架分离3 min；（4）磁力分离后，用0.1%PBST洗涤后，用PBS缓冲液重悬即得捕获有蜡样芽孢杆菌的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-蜡样芽孢杆菌抗原复合物。

所述多臂井星聚合物为多臂井星化聚酰胺-胺，其分子量为70000 Da。结构如图1。

所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm，优选为30 nm。

多臂井星聚合物通过氨基和蜡样芽孢杆菌特异性抗体的羧基实现多臂井星聚合物和抗体的共价偶联。