[发明专利]磁珠分离大肠杆菌O157的方法

权利要求书

1.磁珠分离大肠杆菌O157的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)扫帚分子与大肠杆菌O157 特异性抗体偶联，摩尔偶联比为1:1，形成扫帚分子-抗体复合物；

(2)将扫帚分子-抗体复合物与长链生物素偶联，加入过量长链生物素以封闭扫帚分子上裸露的氨基位点，形成长链生物素-扫帚分子-抗体复合物;

(3)将上述长链生物素-扫帚分子-抗体复合物溶液加入到样品溶液中，以捕获样品溶液中的目的菌E.coli O157，形成长链生物素-扫帚分子-抗体-E.coli O157抗原复合物；

(4)将修饰有链霉亲和素的纳米磁珠加入到上述混合溶液中通过链霉亲和素与长链生物素的亲和作用捕获长链生物素-扫帚分子-抗体-E.coli O157抗原复合物，以形成终复合物纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-扫帚分子-抗体-E.coli O157抗原；将终复合物溶液磁力分离，去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有大肠杆菌O157的磁珠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述扫帚分子为氨基化的线性化聚酰胺-胺，其分子量为13000 Da。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中扫帚分子通过氨基和E.coli O157特异性抗体的羧基实现扫帚分子和抗体的共价偶联。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中扫帚分子通过氨基和长链生物素分子的羧基，实现扫帚分子和长链生物素的共价偶联；加入过量长链生物素以保证封闭扫帚分子上裸露的氨基位点。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm ，优选为30 nm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述的制备摩尔偶联比为1:1的扫帚分子-抗体复合物，按照如下步骤制备:

（1）取1 mg氨基化的扫帚分子溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；

（2）取11.5 mg E.coli O157特异性抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的长链生物素-扫帚分子-抗体复合物按照如下步骤制备：

（1）取15 mg 长链生物素，3.6 mg NHSS，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；

（2）将0.53 mg扫帚分子-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）和（4）具体包括如下步骤：

取1 mL待测样品溶液，加入0.15 mg E.coli O157抗体和长链生物素共修饰的扫帚分子，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.15 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，常规磁力架分离3 min；磁力分离后，去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有大肠杆菌O157的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-扫帚分子-抗体-E.coli O157抗原复合物。