[发明专利]磁珠分离大肠杆菌O157的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于纳米磁珠的食源性致病菌分离方法。

背景技术

食源性致病菌污染是我国食品安全的重大问题之一。据WHO统计，发达国家每年约有三分之一的人感染食源性疾病，全世界每年有220万人因患食源性疾病而丧生。在我国，每年食物中毒例数在20～40万人，除意外事故外，大部分均由食源性致病菌引起。其中，大肠杆菌O157 (Escherichia coli O157, E.coli O157)作为主要的致病菌之一，由其引起的中毒事件时有发生，危害严重，主要表现在可引起腹泻、出血性肠炎，且极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症。因此，发展快速、高效富集分离样品中大肠杆菌O157的技术，从而为实现其简单、快速、灵敏的检测提供前提显得极为重要。 

免疫磁分离技术是食源性致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌，提高致病菌检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法（IMS）将目标菌抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标菌进行捕获、富集，磁分离（具体原理见图2A）。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1）微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细菌细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细菌细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在食品基质液中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）传统的免疫磁分离技术，往往是将抗体分子直接偶联于免疫磁珠上，此过程常常会导致抗体的活性大大地降低并且导致抗体的空间方向发生改变增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低了抗体的捕获效率5）食品基质性质复杂并且其中非目的致病菌的杂菌浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对食品样液中目的菌的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成细菌细胞的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败7） 磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种捕获效率高、简便分离时间短，低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的食品基质中目的菌大肠杆菌O157特异性快速分离的方法。包括如下步骤：

磁珠分离大肠杆菌O157的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）扫帚分子与大肠杆菌O157 特异性抗体偶联，摩尔偶联比为1:1，形成扫帚分子-抗体复合物；

（2）将扫帚分子-抗体复合物与长链生物素偶联，加入过量长链生物素以封闭扫帚分子上裸露的氨基位点，形成长链生物素-扫帚分子-抗体复合物;

（3）将上述长链生物素-扫帚分子-抗体复合物溶液加入到样品溶液中，以捕获样品溶液中的目的菌E.coli O157，形成长链生物素-扫帚分子-抗体-E.coli O157抗原复合物；

（4）将修饰有链霉亲和素的纳米磁珠加入到上述混合溶液中通过链霉亲和素与长链生物素的亲和作用捕获长链生物素-扫帚分子-抗体-E.coli O157抗原复合物，以形成终复合物纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-扫帚分子-抗体-E.coli O157抗原；将终复合物溶液磁力分离，去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有大肠杆菌O157的磁珠。

所述扫帚分子为氨基化的线性化聚酰胺-胺，其分子量为13000 Da。

步骤（1）中扫帚分子通过氨基和E.coli O157特异性抗体的羧基实现扫帚分子和抗体的共价偶联。

步骤（2）中扫帚分子通过氨基和长链生物素分子的羧基，实现扫帚分子和长链生物素的共价偶联；加入过量长链生物素以保证封闭扫帚分子上裸露的氨基位点。

所述纳米磁珠粒径为20-50 nm ，优选为30 nm。