[发明专利]一种高效快速的富集分离副溶血性弧菌方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于纳米磁珠的食源性致病菌分离方法。

背景技术

副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus，VP），弧菌属，是一种革兰阴性嗜盐的多形态细菌。广泛分布于近海岸的海水、海底泥沙、浮游生物和鱼、 虾、贝类等海产品中。能引起急性肠胃炎和原发性败血症，据卫生部报告， 2008年第2季度全国食物中毒情况中副溶血性弧菌引起的食物中毒居微生物性食物中毒的第2位，仅次于蜡样芽胞杆菌。建立一种高效快速检测副溶血性弧菌的新方法显得尤为迫切，鉴于需要建立一种高效，快速的检测方法，免疫磁分离技术在食源性致病菌监测中得到了迅速发展。

免疫磁分离技术是食源性致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌、提高致病菌检测灵敏度和缩短检测时间。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法（IMS）将目标菌抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标菌进行捕获、富集，磁分离（具体原理见图2A）。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1）微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细菌细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细菌细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在食品基质液中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）传统的免疫磁分离技术，往往是将抗体分子直接偶联于免疫磁珠上，此过程常常会导致抗体的活性大大地降低并且导致抗体的空间方向发生改变增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低了抗体的捕获效率5）食品基质性质复杂并且其中非目的致病菌的杂菌浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对食品样液中目的菌的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成细菌细胞的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败；7）磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种捕获效率高、简便、分离时间短，低梯度磁场下（小于30 T/m）从复杂的食品基质中快速、特异分离目的菌副溶血性弧菌的方法。

一种高效快速的富集分离副溶血性弧菌方法，包括以下步骤：

（1）每取1 mg树状超支聚合物溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；加入2.68 mg副溶血性弧菌特异性抗体，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树状超支聚合物-抗体复合物；（2）取15 mg 长链生物素，3.6 mgN-羟基丁二酰亚胺NHSS，2.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；加入2.24 mg树状超支聚合物-抗体复合物，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-树状超支聚合物-抗体复合物；（3）取1 mL待测样品溶液，加入0.1 mg副溶血性弧菌抗体和长链生物素共修饰的树状超支聚合物即长链生物素-树状超支聚合物-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min，常规磁力架分离3 min；（4）磁力分离后，用0.1% PBST洗涤后，用PBS缓冲液重悬即得捕获有副溶血性弧菌的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状超支聚合物-抗体-副溶血性弧菌抗原复合物。

所述树状超支聚合物为为氨基化的树枝状化聚酰胺-胺，其分子量为56000 Da。结构如图1。

所述纳米磁珠粒径为20-50nm，优选为30 nm。

树状超支聚合物通过氨基和副溶血性弧菌特异性抗体的羧基实现树状超支聚合物和抗体的共价偶联。

树状超支聚合物通过氨基和长链生物素分子的羧基，实现树状超支聚合物和长链生物素的共价偶联；加入过量长链生物素以保证封闭树状超支聚合物上裸露的氨基位点。