[发明专利]分型诊断口蹄疫病毒的引物、探针及其试剂盒和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于病毒分型诊断的引物、探针及其试剂盒和使用方法，尤其涉及一种用于诊断O型、AsiaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型口蹄疫病毒的引物、探针及其试剂盒和使用方法，属于口蹄疫病毒检测领域。

背景技术

口蹄疫(Food and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Food and Mouth Disease Virus，FMDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，主要感染偶蹄类动物，如猪、牛、羊等。口蹄疫一旦暴发，将会给畜牧养殖业，尤其是进出口贸易造成巨大损失，因此该病也被世界动物卫生组织(OIE)列为15个A类动物疫病之首，我国政府也将FMD排在14个一类动物传染病的第一位。

口蹄疫病毒有七种血清型，其中O型和A型分布最广，除欧洲外，在非洲、南亚、中东和南美许多地区也有发生，C型仅局限于印度次大陆，AsiaI型通常只发生在亚洲，STA1、2、3型只见于非洲地区，在我国曾出现过O型、A型和AsiaI型的疫情。七种血清型的主要区别在于其结构蛋白氨基酸组成数与排列顺序的不同引起的蛋白二级结构的差异，其中VP1基因最容易发生变异，不同血清型之间的变异率约为30％-50％，其次是VP3和VP2。口蹄疫病毒血清型分类最早是在1922年，由法国学者Vallee和Carre通过田间重复感染现象的观察和交叉免疫试验发现的，1997年，我国台湾FMD大流行时曾致使新生仔猪的死亡率高达100％，造成了重大的经济损失。

目前，口蹄疫的实验室诊断方法主要包括病原生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法三大类。其中，病原生物学方法和免疫学方法对实际样品具有一定的依赖性，灵敏度不高，尤其是对于免疫动物、感染并有症状动物与已感染但尚未出现发病症状动物难以进行区分和及时有效的判断，而基于核酸检测的分子生物学方法可从根本上解决这一难题，具有特异性强、灵敏度高等特点。因此，实时荧光定量PCR核酸分子诊断方法成为口蹄疫病毒诊断的标准方法。然而，现有标准方法只针对通用型口蹄疫病毒检测，不能对口蹄疫病毒进行分型鉴别，需在实验室操作，检测周期较长。

反向斑点杂交(reversedot blot，RDB)是1985年由Saiki等提出的一种斑点杂交技术，并将其应用于血液病和Beta地中海贫血的检测，RDB只需要相对较短的寡核苷酸探针就能提供明显的杂交信号，通过调整杂交条件可以鉴别出模板中一个碱基的差异。该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳转印杂交具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点，尤其是在基因分型、基因突变检测、病原体的检测等方面有其独特的优势，但是传统的杂交技术都需要再高温条件下进行，需要一定的仪器设备的支持，在实地应用的过程中仍然会受到一定的限制。

发明内容

本发明的主要目的是提供一套用于分型诊断口蹄疫病毒的引物和探针，可用于O型或者AsiaI型或者A型或者C型或者SAT1型或者SAT2型或者SAT3型的口蹄疫病毒或者其中的两种或者三种或者四种或者五种或者六种或者七种血清型口蹄疫病毒的聚合酶链反应-反向斑点杂交分型诊断。

所述引物针对各血清型的保守片段设计，O型、AsiaI型、A型、C型四种口蹄疫病毒共用一条上游引物(SEQ No.1)、SAT1型、SAT2型、SAT3型三种口蹄疫病毒共用一条上游引物(SEQ No.2)，七种口蹄疫病毒共用一条下游引物(SEQNo.3)，引物5’端均使用生物素进行标记，其核苷酸序列为：

所述探针针对各血清型的型特异性片段设计，探针5’端均加有10个T尾，其核苷酸序列为：