[发明专利]循环利用裂殖壶菌发酵清液生产DHA油脂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，更具体地说，涉及一种循环利用裂殖壶菌发酵清液的方法。

背景技术

裂殖壶菌(Schizochytrium limacimum)是一种优良的生产多不饱和脂肪酸油脂的资源。目前，利用裂殖壶菌大规模发酵生产多不饱和脂肪酸油脂得到很多科研院所和单位的关注，并对其生产过程进行了深入的研究。

张学成等在公开号CN101824442A中提供了一种裂殖壶菌的发酵生产工艺，可以解决现有技术存在的产量较低、生产成本较高的问题。采用以下技术方案：以豆粕作为主要氮源发酵生产，通过豆粕水解―压滤―发酵培养基的配制―发酵罐体系的设置―裂殖壶菌的收集和干燥制得裂殖壶菌干粉。本发明以豆粕作为主要氮源的裂殖壶菌发酵生产新工艺，不仅降低了发酵生产的成本，而且提高了裂殖壶菌的生长速率，促进裂殖壶菌细胞的脂肪酸积累。将豆粕作为裂殖壶菌发酵生产的培养基组成对降低其生产成本是非常好的尝试。

杨勇、郗大兴在公开号CN101892160A中提供了一种海洋真菌裂殖壶菌LX0809，其具有高产二十二碳六烯酸(DHA)的能力。本发明所述的裂殖壶菌LX0809分离自辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩里采集的腐土，已于2009年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3535，所述裂殖壶菌LX0809通过补料发酵，发酵液的细胞干重可达到72.5g/L，DHA的产量达到15.3g/L。LX0809菌体细胞及其提取物既可用作食用油、乳制品和谷物制品等的食品添加剂，也可作为水产和畜牧养殖等的饲料添加剂。菌体细胞中的饱和甘油三酯，经催化转酯化反应可制得生物柴油。对于裂殖壶菌菌体分离、发酵生产、产品应用都进行了细致的研究，对于指导裂殖壶菌的工业应用给出了建设性的意见。

但是上述研究中裂殖壶菌发酵产生的发酵清液占发酵用水总量的70.0-80.0%，发酵废水排放量大，处理费用高，且裂殖壶菌培养基过程中，添加一定量的海水晶，使得发酵废水中含有一定的盐度，发酵废水处理工艺较复杂，费用较高。

发明内容

为了解决上述问题，降低裂殖壶菌发酵生产废水的排放量，且减少配置发酵培养基的用水量，节省大量水资源及废水处理设备投资和处理费用，本发明提供了一种循环利用裂殖壶菌发酵清液的方法，通过自然沉降获得的部分发酵清液，无需灭菌即可直接投入下一批次发酵所需的无菌培养基，降低了能耗，是一种绿色的清洁生产工艺，具有重要的工业应用价值。

A、发酵培养步骤

A1、配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，MgSO₄2.0g/L，KH₂PO₄2.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

A2、配制发酵培养基：葡萄糖100.0g/L，酵母浸粉15.0g/L，MgSO₄1.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NaNO₃5.0g/L，海水晶10.0g/L；初始pH值为6.0，121℃灭菌30min，冷却备用；

A3、摇瓶种子培养：向摇瓶种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量为4%（V/V），在摇床转速180rpm、培养温度25.0℃的条件下进行摇瓶培养；

A4、种子扩大培养：将（1）中摇瓶培养48小时的种子液接入5-50L种子培养罐中，接种量为4%（V/V），在转速180rpm，通气比1.2vvm，培养温度25.0℃的条件下进行种子扩大培养；

A5、发酵罐放大培养：将（2）中种子扩大培养罐培养48小时的种子液接入100-1000L发酵生产罐中进行培养；接种量为4%（V/V）；通气比0.5-1.5vvm，通过控制搅拌转速调节溶氧水平，其中，发酵1-3天控制溶氧值15-25%，发酵4-7天控制溶氧值5-20%，从发酵第3天开始流加500.0g/L的葡萄糖溶液，控制发酵罐中葡萄糖浓度维持在20.0g/L，发酵7-8天后，停止发酵；

B、菌体分离步骤

B1、将发酵罐中的发酵液自然沉降1-3小时，让绝大部分的菌体沉降，此时，发酵清液和沉降菌体之间有明显的界限，借助发酵罐内大于缓冲罐的压力，通过取样管及无菌管道将发酵罐上部20-50%的发酵清液压出后，导入无菌的缓冲罐备用；