[发明专利]一种将人类成纤维细胞转分化为视网膜色素上皮细胞的方法

权利要求书

1.一种在体外将哺乳动物成纤维细胞转分化为视网膜色素上皮细胞的方法，所述方法包括以下步骤： 

a)构建分别含有编码哺乳动物转录调控因子cMyc、MitfA、Otx2、Rax和Crx的基因序列的转染载体； 

b)构建含有在视网膜色素上皮细胞特异性启动子控制下的报告基因的转染载体； 

c)将所述步骤a)中构建的转染载体和所述步骤b)中构建的转染载体转染到在用于培养哺乳动物体细胞的培养基中培养的所述哺乳动物成纤维细胞中； 

d)在转染后将所述用于培养哺乳动物体细胞的培养基换成用于培养哺乳动物干细胞的培养基继续培养直至观察到细胞开始出现形态改变； 

e)将所述用于培养哺乳动物胚胎干细胞的培养基换成含有基质胶的用于哺乳动物胚胎干细胞到神经干细胞分化的培养基继续培养以使所述哺乳动物成纤维细胞进一步分化； 

f)将所述含有基质胶的用于哺乳动物胚胎干细胞到神经干细胞分化的培养基换成用于培养视网膜色素上皮细胞的培养基继续培养直至获得所述报告基因的阳性细胞克隆。 

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猫、牛、兔、马、猪、猴等。 

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述哺乳动物是人。 

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤a)还包括构建分别含有转录调控因子Pax6、Nrl和Klf4的基因序列的转染载体。 

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述报告基因的阳性细胞克隆先后在含有视黄酸(RA)和Sonic Hedgehog(SHH)的用于培养视网膜色素上皮细胞的培养基中继续培养直至观察到明显的黑色素细胞。 

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述视网膜色素上皮细胞特异性启动子是Bestrophin1(Best1)基因的启动子。 

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述Bestrophin1(Best1)基因的启动子的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。 

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告基因是荧光蛋白的基因，例如绿色荧光蛋白的基因。 

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤a)和b)中使用的载体是逆转录病毒载体。 

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述调控因子Rax的基因序列如SEQ ID NO.3所示；所述调控因子Crx的基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述调控因子MitfA的基因序列如SEQ ID NO.6所示；所述调控因子Otx2的基因序列如SEQ ID NO.7所示；所述调控因子cMyc的基因序列如SEQ ID NO.9所示。 

11.根据权利要求3所述的方法，其中所述调控因子Pax6的基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述调控因子Nrl的基因序列如SEQ ID NO.8所示；所述调控因子Klf4的基因序列如SEQ ID NO.10所示。 

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述用于培养哺乳动物体细胞的培养基是哺乳动物体细胞培养基；所述用于培养哺乳动物胚胎干细胞的培养基是CDF12培养基；所述用于哺乳动物胚胎干细胞到神经干细胞分化的培养基是N2/B27培养基；并且，所述用于培养视网膜色素上皮细胞的培养基是RPE基础培养基。 

13.利用根据前述任一项权利要求所述的方法获得的视网膜色素上皮细胞。