[发明专利]一种将人类成纤维细胞转分化为视网膜色素上皮细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分化领域。具体地，本发明涉及在体外将哺乳动物成纤维细胞转分化为视网膜色素上皮细胞的方法。

背景技术

视网膜退行性疾病是视网膜内特殊细胞群的退行病变，往往导致视力损害甚至失明。其主要病理基础是视网膜各级神经元的结构和功能性异常，最终造成患者视力的不可逆性损害。黄斑变性是一种常见的视网膜退行性疾病，致盲性极高，主要与视网膜色素上皮细胞功能紊乱和老化有关。因为这些致盲性的视网膜变性性疾病都存在进行性的视网膜细胞丢失，常规的药物治疗缺乏疗效，所以理想的治疗方法是通过细胞移植来代替丢失的细胞或者起到支持细胞的作用，这一可行的防盲治盲方法越来越多地被运用到临床。视网膜色素上皮细胞的再生医学治疗是目前临床治疗视网膜退行性疾病如黄斑变性最有效的手段。

细胞移植材料的来源是再生医学治疗广泛应用的瓶颈之一。以往的细胞来源主要是通过以下几种技术实现从胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化：1.利用自发分化方法从人类多能干细胞获得视网膜色素上皮细胞的技术(Meyer，J.S.，et al.Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.PNAS，2009，106：16698-16703)；2.利用单层分化方法从人类多能干细胞获得视网膜色素上皮细胞的技术(Nakano，T.，et al.Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.Cell stem cell，2012，10：771-785)。3.利用三维培养方法从人类多能干细胞获得视网膜色素上皮细胞的技术(Zhu，Y.，et al.Three-dimensional neuroepithelial culture from human embryonic stem cells and its use for quantitative conversion to retinal pigment epithelium.PloS one，2013，8，e54552)。然而胚胎干细胞由于受到伦理学的限制并不能广泛应用于临床治疗，而诱导性多能干细胞虽然避免了伦理学的限制，但是它分化效率很低，耗时长，并可能存在遗传学和表观遗传学的缺陷和致瘤性，都限制了其在细胞移植的临床应用。

转分化手段的出现使一种类型的分化细胞转变成另一种类型的分化细胞，这就为细胞移植的临床应用提供了大量的细胞来源。这种直接的细胞类型之间的转换绕过了干细胞阶段，理论上可以使移植的致瘤风险大大降低。目前转分化技术已经可以产生多种细胞类型，如神经元、肝细胞、上皮细胞等。但是从人成纤维细胞或其它体细胞类型向视网膜色素上皮细胞的转分化方法目前还没有报道。本发明技术使得临床可以大量获得治疗黄斑变性等视网膜退行性疾病的病人自体移植材料，并且可以用于治疗视网膜退行性疾病药物的筛选。

发明内容

本发明目的是直接从哺乳动物(例如，人)成纤维细胞转分化为视网膜色素上皮细胞，为临床提供大量治疗黄斑变性等视网膜退行性疾病的细胞移植材料，并且应用于治疗视网膜退行性疾病药物的筛选。

本发明涉及一种在体外将哺乳动物成纤维细胞转分化为视网膜色素上皮细胞的方法，所述方法包括将多种转录调控因子和报告基因转入哺乳动物成纤维细胞中，然后使用多种培养基进行培养从而获得视网膜色素上皮细胞。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种在体外将哺乳动物成纤维细胞转分化为视网膜色素上皮细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)构建分别含有编码哺乳动物转录调控因子cMyc、MitfA、Otx2、Rax和Crx的基因序列的转染载体；

b)构建含有在视网膜色素上皮细胞特异性启动子控制下的报告基因的转染载体；

c)将所述步骤a)中构建的转染载体和所述步骤b)中构建的转染载体转染到在用于培养哺乳动物体细胞的培养基中培养的所述哺乳动物成纤维细胞中；

d)在转染后将所述用于培养哺乳动物体细胞的培养基换成用于培养哺乳动物干细胞的培养基继续培养直至观察到细胞开始出现形态改变；