[发明专利]大豆转基因株系混合生根方法

权利要求书

1.一种大豆生根方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖；

(b)对步骤a)所述胚尖，在针对所述抗性筛选基因的第一筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性芽及胚轴；

(c)将步骤b)获得的所述抗性芽及胚轴，在针对所述抗性筛选基因的第二筛选压力条件下，在进行筛选培养6-20天；

(d)将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴，进行生根培养直至所述胚轴下端长出根系。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二筛选压力≤第一筛选压力。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，所述的生根培养在第三筛选压力下进行。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第三筛选压力≤第二筛选压力≤第一筛选压力。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用根癌农杆工程菌浸染大豆胚尖获得所述转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖，其中，所述根癌农杆工程菌经以下步骤获得：

从含卡那霉素的YEP培养平板上挑取含有质粒pCAMBIA2301的根癌农杆菌单菌落接种于含有45-55mg.L^-1利福平和45-50mg.L^-1卡那霉素的YEP液体培养基培养，经活化后离心分离，收集菌体，重悬于液体MS基本培养基中，其中，

所述质粒pCAMBIA2301带有CaMV35S启动的β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因和CaMV35S启动的新霉素转移酶(nptⅡ)基因。

6.如权利要求1所述的方法，其他特征在于，所述步骤b)将所述胚尖置于含0.25-35mg.L^-1GA、150-250mg.L^-1替卡西林及50-150mg.L^-1卡那霉素的MS基本培养基或MSB5培养基中筛选培养6-25天，15-18h/d光照，温度为24-26℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中，将所述抗性芽及胚轴含置于50-150mg.L^-1替卡西林，30-80mg.L^-1卡那霉素的1/8MS基本培养基或1/8MSB5培养基中，于14-18h/d光照，25±1℃条件下进行筛选培养。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d)包括二个子步骤：

(d1)将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴进行生根培养至所述胚轴下端发根；

(d2)将经步骤d1)生根培养后的所述抗性芽及胚轴进行培养至所述胚轴长出10-15cm根系。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d1)中，将所述抗性芽及胚轴置于含0.5-1.5mg.L^-1IBA(吲哚丁酸)，50-150mg.L^-1替卡西林，30-80mg.L^-1卡那霉素的1/4MS基本培养基或1/4MSB5培养基中于14-18h/d光照，25±1℃条件下生根培养；和/或

所述步骤d2)中，将所述生根培养后的所述抗性芽及胚轴转接到含0.5-1.5mg.L^-1IBA，50-150mg.L^-1替卡西林，30-80mg.L^-1卡那霉素的1/2MS基本培养基或1/2MSB5培养基中于14-18h/d光照，25±1℃条件下培养。

10.一种转基因大豆种子的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(i)种植多个大豆转基因株系至结荚，其间，进行叶片GUS染色、PCR检测及Southern blot检测；

(ii)取GUS染色、PCR检测及Southern blot检测为阳性的转基因株系，收获并保存种子，为T0代转基因大豆种子；以及任选地，

(iii)种植所述T0代种子，苗期进行GUS染色、PCR检测，收获并保存结果均为阳性的株系的种子，为T1代转基因大豆种子；以及任选地，

(iv)种植所述T1代种子，苗期进行GUS染色、PCR检测，收获并保存结果均为阳性的株系的种子，为T2代转基因大豆种子，

其中，所述大豆转基因株系来源于同一个由权利要求1所述的方法获得的长出根系的胚轴。