[发明专利]大豆转基因株系混合生根方法

说明书

技术领域

本发明涉及大豆种植，具体涉及一种大豆转基因株系混合生根方法。

背景技术

大豆(Glycine max(L.)Merrill)起源于中国，是我国重要粮食作物之一，已有五千年栽培历史，现知有1000个栽培品种。大豆含脂肪约20%，蛋白质约40%，还含有丰富的维生素，富含营养，除供直接食用外，可作酱、酱油和各种豆制食品；茎、叶、豆粕及粗豆粉作肥料和优良的牲畜饲料。豆粕经加工制成的组织蛋白、浓缩蛋白、分离蛋白和纤维蛋白等是多种产品，如人造肉、干酪素、味精及造纸、塑胶工业、人造纤维、火药等的原料。豆油除主要供食用外，并为润滑剂、油漆、肥皂、瓷釉、人造橡胶、防腐剂等重要原料。此外药用有滋补养心、祛风明目、清热利水、活血解毒等功效(韦直等，中国植物志，北京：科学出版社，1995，234-236)，因此大豆具有重要的研究价值。

1952年，中国大豆总产为952×104t，人均占有量约25kg，2003年大豆总产量超过1.539×107t，但因人口增加，人均占有量下降到11.8kg。随着国民经济的发展和人民生活水平的提高，加工业、食品业和畜牧业的发展，对大豆的需求急剧增加，大豆供求矛盾日益突出。目前扩大大豆种植的潜力是有限的，而提高单产还有很大的空间和潜力(赵团结等，中国农业科学，2006，39(1)：29-37)。

大多数基因型的大豆都来源于同一祖先，因此常规育种方法对扩大大豆产量的帮助是很有限的(Hiromoto等，Brazil Journal of Genetics1986,2:295-306)，但是通过先进的离体培养技术和基因技术可以为优化大豆种质资源，为提高抗病虫害能力提供了关键性的技术帮助。

目前，尽管大豆的胚尖和子叶节两个受体系统的再生频率很高，但大豆的转基因频率偏低，一般低于2%(Cao等，Plant Cell Tissue and Organ Culture2009,96:45-52)。主要原因是转基因大豆抗性芽经过长时间筛选压后长势弱化，离体生根能力下降，不定根的长势相对弱化。

因此，本领域尚需提供一种新型的生根方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的高效离体生根方法—带胚轴生根法。

本发明的第一方面，提供一种大豆生根方法，包括以下步骤：

(a)提供一转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖；

(b)对步骤a)所述胚尖，在针对所述抗性筛选基因的第一筛选压力条件下，进行筛选培养，获得抗性芽及胚轴；

(c)将步骤b)获得的所述抗性芽及胚轴，在针对所述抗性筛选基因的第二筛选压力条件下，在进行筛选培养6-20天；

(d)将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴，进行生根培养直至所述胚轴下端长出根系。

在另一优选例中，所述的第二筛选压力≤第一筛选压力。

在另一优选例中，在步骤(d)中，所述的生根培养在第三筛选压力下进行。

在另一优选例中，所述的第三筛选压力≤第二筛选压力≤第一筛选压力。

在另一优选例中，所述的第三筛选压力≤第二筛选压力＜第一筛选压力。

在另一优选例中，所述的第三筛选压力＜第一筛选压力；且第二筛选压力＜第一筛选压力。

在另一优选例中，所述的第三筛选压力≤1/2的第一筛选压力；且第二筛选压力≤1/2的第一筛选压力。

在另一优选例中，所述的外源目的基因和抗性筛选基因位于同一质粒上。

在另一优选例中，所述的外源目的基因和抗性筛选基因位于农杆菌质粒上。

在另一优选例中，所述的农杆菌质粒为pCAMBIA2301。

在另一优选例中，所述的抗性芽及胚轴是一体的。

在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因。

在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第一筛选压力为50-150mg.L^-1的卡那霉素浓度。

在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第二筛选压力为30-80mg.L^-1的卡那霉素浓度。

在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第三筛选压力为30-80mg.L^-1的卡那霉素浓度。

在另一优选例中，采用根癌农杆工程菌浸染大豆胚尖获得所述转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖，其中，所述根癌农杆工程菌经以下步骤获得：