[发明专利]一种重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法

权利要求书

1.一种重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括猪白细胞介素4部分和Fc片段部分，所述猪白细胞介素4部分为猪白细胞介素4胞外区的全部序列，所述Fc片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪白细胞介素4与Fc片段部分之间为直接融合。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种编码权利要求2中所述的融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种载体，所述载体含有权利要求3的基因。

5.如权利要求4所述的载体，所述载体为pET21b。

6.一种大肠杆菌，所述大肠杆菌具有权利要求4或5的载体。

7.如权利要求6所述的大肠杆菌，所述大肠杆菌为BL21（DE3）菌株。

8.一种重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白的原核细胞表达方法，包括如下步骤：

（1）在合适的条件下于培养基中培育权利要求7中所述的大肠杆菌；

（2）从大肠杆菌和/或培养基中分离重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白。

9.如权利要求8所述的表达方法，包括如下步骤：

（1）挑取一个或多个含有权利要求7中所述的大肠杆菌菌落，接入含抗生素的LB培养液，培养过夜；

（2）取过夜培养物转接入于含抗生素的新鲜LB培养液中，于37℃震荡培养至对数中期OD₆₀₀=1.0；

（3）在培养物中加入浓度为1m mol/L的IPTG，37℃，诱导表达4h后，离心处理收集含有重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌体沉淀。

10.一种重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）将收集得到的如权利要求9所述的含有诱导重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4℃高速离心处理，重复一次；

（2）吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（湿重）加入裂解缓冲液Buffer A3-10mL，搅动缓冲液，使菌体悬起；

（3）每克（湿重）菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动；

（4）破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4℃高速离心处理；

（5）沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4℃高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次；

（6）包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30-60min；

（7）充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白变性溶液；

（8）取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白变性溶液，用变性缓冲液Buffer D将重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白变性溶液的浓度稀释至0.2mg/mL，4℃透析复性24h，将复性后重组蛋白溶液用0.45μm滤膜过滤，即得到重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白复性溶液；

所述重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白复性溶液可进一步超滤浓缩、脱盐至最小体积，低温真空干燥，即获得重组猪白细胞介素4-Fc粉末。