[发明专利]一种重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。

背景技术

白细胞介素4(Interleukin4，IL-4)由活化的T细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞合成分泌，是一种多功能淋巴因子，具有多种复杂的生物学活性，包括调节T淋巴细胞的生长、繁殖和分化；调节受抗原刺激的T细胞分化过程；调节分化后的T细胞能够产生IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等细胞因子；控制免疫球蛋白类型转换的特异性等。此外，IL-4对T细胞、B细胞和NK细胞的诱导反应在清除蠕虫感染，治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面也发挥着重要的调节作用。由此可见，IL-4可用作免疫佐剂、治疗剂以及疾病感染的诊断指标，在疾病预防控制和诊断等方面具有重要的意义。目前，对IL-4在小鼠、兔、羊、牛和人的生物学活性功能研究均有报道，但是对猪IL-4的研究相对较少，并且针对其特异的检测系统和生物学活性评价系统的研究也不多见。

我国是世界养猪大国，面对当前养猪业重大疫病时有发生以及流行病愈加复杂的情形，我们必须运用新的科学理论和生产技术来发展养猪行业，采用高效疫苗预防和控制各种疫病的发生和流行。猪白细胞介素4是猪疫苗研究的重要组成部分，然而天然的猪白细胞介素4在机体内表达甚微，难以从体内大量提取供临床研究及实际应用。基因工程技术可大量生产外源蛋白，满足研究和应用的需求。因此本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可以大量表达重组猪白细胞介素4表达系统和表达方法。

另一方面，作为小分子量蛋白，猪白细胞介素4也与其他白介素一样，存在血浆清除速度较快的缺陷，导致在临床治疗中需要重复多次用药才能达到治疗效果。IgG免疫球蛋白是人和动物体内的主要抗体，它在体内的半衰期可达20天。其稳定性是由于IgG的Fc片段可与新生Fc受体（FcRn）结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。有鉴于此，本发明尝试考虑在猪白细胞介素4上增加IgG的Fc片段来构成融合蛋白，以提高猪白细胞介素4体内半衰期，达到长效的目的。由此，本发明的目的是提供一种既能保留猪白细胞介素4原有活性，又可以延长体内半衰期的猪白细胞介素4与Fc片段的融合蛋白。

然而，通过大肠杆菌表达的重组蛋白多为不溶解、无活性的细胞内聚集物，即包涵体。包涵体的复性是一个非常复杂的过程，如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，一方面降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是采用合适的方法将大肠杆菌表达的蛋白包涵体进行复性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达的重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白以及其基因和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括猪白细胞介素4部分和Fc片段部分，其中，猪白细胞介素4部分为猪白细胞介素4胞外区的全部序列，Fc片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪白细胞介素4与Fc片段部分之间为直接融合。

其中的Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白Fc，是Fc全长或是部分序列，Fc选自IgG、IgM、IgD、IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。本发明的融合蛋白中的Fc片段部分特别优选来自猪的IgG1。

优选地，本发明的重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第2-110位氨基酸残基为猪白细胞介素4的胞外区序列，第111-340位氨基酸残基为猪IgG1序列。

本发明提供了编码上述所述重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白的基因的质粒，所述的质粒优选为原核表达质粒，最优选为pET21b载体。

本发明还提供了包含有上述所述质粒的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21（DE3）菌株。

本发明还提供了重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：

该方法的步骤为：

1.挑取1个或多个含有上述所述重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌落，接入LB培养液，于37℃培养过夜；