[发明专利]2b‑RAD混合建库技术

说明书

技术领域

本发明属于分子基因组学领域，尤其涉及简化基因组测序技术领域。

背景技术

简化基因组测序（reduced-representation sequencing）技术是近几年在二代测序基础上发展起来的一系列技术的总称，主要包括RAD（restriction-site associated DNA）、GBS（genotyping-by-sequencing）、双酶切GBS（two-enzyme genotyping-by-sequencing）、双酶切RAD（double digest restriction-site associated DNA）等技术。

这些技术的基本原理是样品DNA经酶切处理后，对其进行上机测序。测序都只是对样品酶切位点周边区域进行测序，而不是对全基因组进行测序。从已经发表的文献来看，每个样本的下机数据量仅为全基因组大小的0.05-0.5×（不同简化基因组测序技术之间有差异）。由于简化基因组测序技术数据量小、且又能够均匀分布于整个基因组，所以这些技术在低成本基因分型方面正得到越来越广泛的应用，已经被大量用于基因分型之后的遗传连锁图构建、群体遗传多样性评估、种群进化分析等方面。

在目前发表的文献中，简化基因组测序技术主要在Illumina Hiseq平台上进行。因为简化基因组测序技术单个样本数据量小，而Illumina Hiseq测序仪单泳道（lane）容量较大（例如单泳道的SE50原始数据产量在7.5G左右，PE50的原始数据产量在15G左右），所以Illumina Hiseq测序仪单个泳道可容纳几十甚至上百个简化基因组测序的样本。面对如此多的样本，目前发表的文献都采取混合（pooling）建库的方式（见图1）：首先对样本DNA进行酶切，之后在粘性末端的一端连上一段含有条码物（barcode）序列的条码物接头(图1中的接头1)，在另外一端的粘性末端连上一段通用接头（图2中的接头2），然后将连好接头的DNA混合起来作为一个样品（即混合物），最后对这个样 品进行末端修复、加A、PCR、切胶纯化等其余建库操作。这种建库方式，只在酶切及连接接头这两步需要对每个样本进行操作（即一样一库），而在混合之后，则相当于只对一个样本进行操作（即多样一库），与常规Illumina Hiseq建库的一样一库相比，这样就大大节省了人力与时间。

Illumina Hiseq平台的常规测序文库，比如小片段文库、转录本文库等，同样面临一个泳道容纳多个样本的问题。目前的解决方式是在建库进行到PCR步骤时，在两条PCR引物的其中一条上加入一段索引（index），这段引物称为索引引物，（图2中的PCR引物2）。另一段引物称为通用引物（图2中的PCR引物1）。目前，Illumina Hiseq 平台可使用的索引引物有100多个。这样，在PCR产物中将会带有索引，混合上机后根据索引就可区分样本。这样就能混合足够多的样本，使测序仪的所有容量都被使用，测序成本降到最低。这种建库是以一样一库的方式进行，即要对每个样本分别建库，然后在上机时混合起来测序。不如简化基因组的多样一库来得简便。

表1对简化基因组测序技术建库方式与小片段建库方式做了比较。

表1小片段测序与简化基因组测序建库方式比较