[发明专利]一种坏死梭杆菌重组OMP蛋白及制备方法

说明书

 

技术领域

本发明公开一种坏死梭杆菌其重组OMP蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum，F. necrophorum)多寄生在人和动物的口腔、胃肠道及消化道中，是人类和动物多种化脓、坏死病灶的病原菌，由坏死梭杆菌感染引起的疾病统称为坏死梭杆菌病(Necrobacillosis)。坏死梭杆菌感染引起的疾病，常见于动物肝脓肿(liver abscesses)、腐蹄病 (footrot)及人类的急慢性咽喉炎(Lemierre's syndrome)等，多呈慢性经过，治疗不及时，严重影响生产性能，甚至死亡，病灶多见于蹄部、唇部及生殖道，还可引起肝、肾等内脏脓肿坏死，孕畜感染，导致流产或子代发病等。近年来，坏死梭杆菌引起的疾病发病率较高，严重影响养殖业的生产性能，坏死梭杆菌病是重要的传染病之一，给养殖业带来经济损失十分巨大。

实践证实，药物预防存在粪便污染降低药效，传统全菌体灭活菌苗对其他血清型缺乏交叉保护，且成本高，操作复杂、费时。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种坏死梭杆菌重组OMP蛋白，是单一抗原，弥补利用全菌检测坏死梭杆菌抗体技术特异性差的缺点。

本发明的目的之二是提供所述重组OMP蛋白的制备方法，可用于重组OMP蛋白的规模化生产。

本发明的目的之三是提供所述重组OMP蛋白在疫苗中的应用。

本发明公开的梭杆菌属坏死梭杆菌，命名为：梭杆菌属坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum），简称：FN(An)；该疫苗株已于2013年4月19日保藏《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为：CGMCC NO.7672，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供的坏死梭杆菌重组OMP蛋白，编码上述重组蛋白的其氨基酸序列为SEQ ID No.1，核苷酸序列为SEQ ID No.2。

本发明提供一种坏死梭杆菌重组OMP蛋白制备方法，包括以下步骤：

A、以F. necrophorum（An）基因组DNA为模板，序列SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示为上、下游引物，PCR扩增F. necrophorum的OMP基因片段，连接至pMD^?18-T Simple载体，获得克隆重组质粒pMD^?18-T Simple-OMP；

B、限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切pMD^?18-T Simple-OMP和原核表达载体pET28a(+)，连接，获得重组原核表达质粒pET28a-OMP；

C、将上述获得的重组质粒pET28a-OMP转化表达宿主菌中，IPTG诱导表达，获得坏死梭杆菌重组OMP蛋白粗品。

镍亲和层析柱纯化步骤C得到的坏死梭杆菌重组OMP蛋白粗品，获得坏死梭杆菌重组OMP蛋白；

步骤C中的表达为菌株BL21（DE3），在IPTG浓度大于0.4mmol/L，诱导温度高于16℃时，均可获得坏死梭杆菌重组OMP蛋白坏死梭杆菌重组OMP蛋白。

本发明所述的坏死梭杆菌重组OMP蛋白可用于生产制备预防坏死梭杆菌病的疫苗。

本发明的有益效果在于：坏死梭杆菌重组OMP蛋白经western blot检测，发现具有与天然坏死梭杆菌OMP相似的免疫反应活性，可以用于制备坏死梭杆菌基因工程疫苗或作为建立检测坏死梭杆菌特异性诊断方法的检测抗原。

按照本发明生产的产品适用于：

A、本发明产物可作为检测坏死梭杆菌抗体的间接ELISA方法的检测抗原；

B、可用于预防坏死梭杆菌病感染的基因工程亚单位疫苗。

本发明产品优点有：

A、该重组蛋白是单一抗原，弥补利用全菌检测坏死梭杆菌抗体技术特异性差缺点；

B、作为ELISA抗原检测坏死梭杆菌抗体，特异性较强，避免交叉反应的发生；

C、简单易操作、成本低、适合规模化生产，市场前景较好。

附图说明

图1为OMP基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为克隆重组质粒pMD^?18-T Simple-OMP的电泳图；

图3为表达重组质粒pET28a-OMP酶切鉴定电泳图；