[发明专利]一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种人肿瘤疫苗提取方法，尤其涉及一种肿瘤外切酶体（exosome）疫苗的提取方法以及应用。

背景技术

手术治疗是肿瘤的常规治疗方法，除了手术治疗外，过继性细胞免疫治疗也是目前极有潜力的一种肿瘤治疗方法。相比其他治疗手段，过继性细胞免疫治疗具有特异性高、副作用小、改善临床体征、延长患者生存时间等优点。体外和动物实验研究表明，过继性细胞对肿瘤细胞具有显著的特异性杀伤效果。

exosome是由许多活细胞的多泡体(muhivesicular bodies，MVBs)与细胞膜融合后向细胞外分泌的一种直径50-100nm的小囊泡。肿瘤细胞来源的exosome已经被证实可以表达丰富的免疫相关蛋白和肿瘤相关抗原，可以引起抗肿瘤的生物学效应，可能成为亚细胞结构的肿瘤疫苗，因此具有重要的研究和应用价值。原有提取exosome的方法只是将exosome这种完整的囊泡结构提取出来，但是囊泡内的大量miRNA以及肿瘤相关抗原无法提取。而恰恰是囊泡内的miRNA以及肿瘤相关抗原才是激活免疫细胞的重要成分。所以很有必要发明一种提取exosome囊泡内物质的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤外切酶体（exosome）疫苗的提取方法，通过以下步骤实现：

 1.提取exosome：胎牛血清在4℃条件下，100000×g离心6h，除去内源性exosome，人胆管癌细胞（RBE细胞）在含10％的胎牛血清的1640培养液中，培养约72h，收集培养基上清。按药品生产质量管理规范（GMP）标准提取exosome：上清300×g离心5min、转移至新的离心管800×g离心30min，转移至新的离心管10000×g离心30min，去除细胞碎片；上清液再用millipore公司100 kd超滤管，以1500×g离心30min；将浓缩液移至30 g／L的蔗糖重水垫上，以100000×g超速离心60min。取出蔗糖重水垫，稀释到50ml的PBS中，再用100kd 超滤管，以1500×g离心，直至体积<5 ml，以0.22um的滤器过滤除菌，分装后置于—80℃冰箱备用。

2.提取exosome裂解超滤液：取超速离心后的exosome沉淀，加入去离子水10ml，低渗法使exosome破膜，用millipore公司10kd超滤管4000×g离心30min去除miRNA提纯exosome裂解超滤液。

本发明的另一个目的是提供所述方法在获得不含miRNA的exosome裂解超滤液中应用。

本发明从人胆管癌细胞（RBE细胞株）的培养液（购自中科院上海细胞库）上清中成功提取了exosome，并且通过超滤裂解的方法提取了不含miRNA的exosome裂解超滤液，分别加入到未成熟的树突状细胞(imDC)与细胞毒性T淋巴细胞（CTL细胞）的混合培养体系中，使之产生特异性肿瘤细胞杀伤作用，实验结果证明了通过裂解超滤的方法得到的不含miRNA的exosome裂解超滤液能够更加明显的刺激免疫细胞产生特异性的肿瘤杀伤作用，为基于exosome裂解超滤液的过继性细胞免疫治疗打下实验基础，并为肿瘤免疫治疗提供新的方法与思路。

使用本发明可以在原有exosome提取的基础上，将exosome囊泡内的微小RNA、肿瘤抗原相关蛋白等大量具有肿瘤免疫原性的物质充分释放，同时又不破坏这些内容物（含有大量miRNA以及大量肿瘤相关抗原），从而大大的提高exosome的肿瘤特异性免疫原性，以便于接下来的免疫识别、提呈、反应等，实验证明能大幅提高免疫细胞对肿瘤产生的特异性免疫应答的杀伤效果以及降低肿瘤细胞的免疫逃逸水平，即大大增强人体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

附图说明

图1是普通DC/CTL细胞（DC/CTL组）、exosome致敏DC/CTL细胞（E-DC/CTL组）、exosome裂解超滤液致敏DC/CTL细胞（EL-DC/CTL组）分别杀伤RBE细胞的杀伤率对比图。

图2是exosome囊泡的电子显微镜图片。     图3是exosome囊泡经过裂解超滤法处理后的电子显微镜图片。

图4是正常生长的人胆管癌细胞（RBE细胞）图片。

图5是用exosome裂解超滤液致敏的DC/CTL细胞（树突状细胞与细胞毒性T淋巴细胞）杀伤RBE细胞后的倒置显微镜图片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一