[发明专利]一种从赭色小莫勒菌中高效提取3β-乙酰基-15α，22-二羟基何帕烷酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从赭色小莫勒菌中提3β-乙酰基-15α，22-二羟基何帕烷酮的方法。

背景技术

      赭色小莫勒菌（Moelleriella ochracea）隶属于子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科、莫勒菌属。莫勒菌是一种虫生真菌，由于其独特的生活方式，不仅是重要的生物防治材料，同时还是宝贵的药用资源。它具有抗结核杆菌，抗癌，杀疟原虫等生物活性，Watts等从莫勒属的菌株中获得细皱青霉素和醌茜素，二者对昆虫细胞显示出很强的抑制作用，其ID₅₀值分别为1.2 μg/mL和9.6 μg/mL，已知醌茜素还具有治疗糖尿病的功效，目标物3β-乙酰基-15α，22-二羟基何帕烷酮，是一种三萜类物质，具有抗结核杆菌的活性，IC₅₀为12.5 μg/ml，在医学应用上具有潜在的价值。

发明内容

本发明的目的是公开一种从赭色小莫勒菌中提取3β-乙酰基-15α，22-二羟基何帕烷酮的方法，以促进其在医学领域的开发和应用。

本发明的从赭色小莫勒菌中高效提取三萜类物质3β-乙酰基-15α，22-二羟基何帕烷酮的方法，包括菌株培养、有机溶剂萃取、硅胶柱分离、薄层色谱纯化、重结晶。

具体步骤如下：

1)菌株培养：取赭色小莫勒菌的菌块接种到PDB培养基中，在100~160r/min、24~28℃条件下连续培养7~10天即一级培养，按8％~10％接种量再次转接到PDB培养基中，在100~160r/min、24~28℃条件下再连续培养7~10天即二级培养，按8％~10％接种量再次转接到PDB培养基中，在24℃~28℃条件下静止培养35~40天即三级培养；

2) 有机溶剂萃取：三级培养的菌液与菌丝体过滤分离，菌液用乙酸乙酯摇瓶萃取，菌液与乙酸乙酯的体积比=2：1～1:1，摇瓶转速150r/min～250r/min，温度15～20℃，摇5h～10h后，静止12h～20h,旋蒸乙酸乙酯部分浓缩得浸膏，回收乙酸乙酯；

3）硅胶柱分离：1倍浸膏体积的乙酸乙酯溶解浸膏，上200-300目硅胶柱，用洗脱液洗脱，收集含有目标物的流出液，旋蒸浓缩得粗提物；

4）薄层色谱纯化：将粗提物用1倍浸膏体积的乙酸乙酯溶解，点样到薄层制备色谱板上，放入层析缸中，层析液为甲醇：二氯甲烷体积比=1:20的展开体系；待展开体系爬到板的上沿时取出薄层制备色谱板，沿直线刮取R_f=0.43处的硅胶，氯仿浸泡刮取的硅胶，过滤除去硅胶，旋蒸浓缩氯仿浸泡液，得白色物质；

5）重结晶：白色物质用氯仿溶解，放在4℃冰箱里挥干，得白色晶体物质即赭色小莫勒菌中3β-乙酰基-15α，22-二羟基何帕烷酮。

其中，所述步骤（1）PDB培养基为：4g马铃薯粉，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。

所述步骤（3）洗脱液为石油醚：乙酸乙酯体积比=15:1，等度洗脱，洗7～10个柱体积。

本发明的显著优点：

1）            原料取材简单；

2）            设备简单，容易操作，用料成本低；

3）            纯度可达90%。

附图说明

图1： 目标物¹H NMR谱图

图2 ：目标物¹³C NMR谱图

图3 ：3β-乙酰基-15α，22-二羟基何帕烷酮化学结构图

具体实施方式

以下是本发明的几个具体实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

1)菌株培养：取赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1): 148-150）的菌块接种到PDB培养基（4g马铃薯粉，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L）中，在150r/min、25℃条件下连续培养8天即一级培养，按9％接种量再次转接到PDB培养基中，在150r/min、25℃条件下再连续培养8天即二级培养，按9％接种量再次转接到PDB培养基中，在25℃条件下静止培养38天即三级培养。

2) 有机溶剂萃取：三级培养的菌液与菌丝体过滤分离，菌液与乙酸乙酯体积比=1.5:1摇瓶萃取，摇瓶转速200r/min，温度18℃，摇8h后，静止15h,旋蒸乙酸乙酯部分浓缩得浸膏，回收乙酸乙酯。