[发明专利]一种生产饲用抗菌肽的家蚕生物反应器及其构建方法

说明书

 

技术领域

 本发明属于基因工程领域，涉及一种共表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin AD的家蚕生物反应器构建方法，尤其涉及利用重组杆状病毒在昆虫体内表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin AD的方法，可用于制备饲用抗菌肽添加剂。

背景技术

随着耐药菌和细菌多重耐药现象的不断出现，寻求安全有效的抗生素或其替代品成为医药行业亟待解决的问题。抗菌肽因具有抗菌谱广、热稳定性好、抗菌机制独特、不易产生耐药性等优点，有望成为解决这一难题的有效方法。抗菌肽是一种由多种生物体分泌的、具有广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫、抗肿瘤和促进伤口愈合及血管新生等作用，且不破坏真核细胞、无免疫原性，极有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源，是很多生物先天非特异性防御系统的重要组成部分。

天蚕素(cecropins)是1980年瑞典科学家Boman等从蚕蛹中分离得到第一个抗菌肽。目前，已发现1700多种抗菌肽，而天蚕素是目前研究最为清楚、效果最为明显的抗菌肽。天蚕素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。天蚕素(cecropins)对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。此外，研究表明牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd对多种细菌产生明显的抑制作用，具有较好的应用前景。牛蛙抗菌肽主要存在蛙体皮肤组织的腺体中，当受到病原微生物的侵袭时被分泌到包裹与皮肤外表面从而形成一道天然屏障，目前已从8个属约40多种的蛙皮中提取了抗菌肽。

由于抗菌肽在动物体内含量极微，从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。因此，人们开始转向利用基因工程方法来研究和解决抗菌肽的生产问题。目前，已进入临床应用的基因工程药物多数是采用原核表达系统生产的，但由于抗菌肽对细菌的杀伤作用，不能用原核表达系统直接表达具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表达，将给表达产物的后处理带来很大麻烦。因此，国内外的研究者多采用真核表达系统进行抗菌肽基因工程研究。近年来，以酵母为基因工程受体菌的研究引起人们的重视，酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌，但由于酵母菌产生内源蛋白产物的种类多，含量高，给抗原肽的纯化带来很多问题，尚需进一步完善和解决。

    现代研究认为家蚕生物反应器基于本身特点有望解决抗原肽的许多生产问题。简而言之，“家蚕生物反应器”是指将特定的重组杆状病毒（基因）植入家蚕的蚕蛹体内进行培养，蚕蛹会主动对植入基因进行转录和翻译，自然生成对人类有用的生物活性物质，以满足疾病的预防、治疗和保健等需求。

近年来，家蚕生物反应器已在医学、兽医学和农业上得到广泛的应用。目前已用家蚕生物反应器成功表达多种人类和动物病毒的抗原蛋白，其中相当一部分正在进行商品化开发。如利用家蚕生物反应器表达不含有病毒的遗传物质病毒样粒子（VLPs），具有的独特结构、展示表位的能力和能有效刺激产生免疫反应，为研究预防多种疾病提供很好的方法。

家蚕杆状病毒表达系统的有关技术已相对成熟，该系统表达外源基因，不仅经济、高效，而且可提供一条新的技术途径。利用家蚕生物反应器共表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin AD，保证其具有正常的蛋白结构和生物活性；之后，将其家蚕处理添加到饲料中，提高饲料的营养价值和动物的抗病能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供了利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin AD的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：