[发明专利]二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达

权利要求书

1.通过在大肠杆菌宿主细胞中重组表达产生双链形式的多肽或蛋白质的方法，所述两条链是二硫桥连的，其中

(i)所述多肽或蛋白质作为双链二硫键桥连的多肽或蛋白质发挥其生物活性；

(ii)第一链的C末端氨基酸残基是碱性氨基酸残基，

(iii)所述蛋白质/多肽的第二链在N末端按照从N到C的方向具有1-20个氨基酸残基和称为PRS的五肽序列VPXGS，其中X是任何天然存在的氨基酸，其中V是Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，其中P是Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，其中G是Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，并且其中S是Ser、Tyr、Trp或Thr；并且

(iv)所述方法包含以下步骤：

(a)在核酸水平修饰多肽或蛋白质，使得经修饰形式的该多肽或蛋白质在其环区域具有序列VPXGS，其中X、V、P、G和S如上所定义；

(b)将核酸水平被修饰的构建体导入到大肠杆菌细胞中；

(c)培养并随后裂解宿主细胞；和

(d)分离所述双链二硫桥连的肽或蛋白质。

2.根据权利要求1的方法，其中所述碱性氨基酸残基是Arg或Lys残基。

3.根据权利要求1的方法，其中所述方法不包括随后添加蛋白如内切蛋白酶的步骤，因为步骤(c)之后获得的多肽或蛋白是以其(生物学上)活性的双链结构存在的。

4.根据权利要求1的方法，其中所述多肽/蛋白质的第一链是该多肽/蛋白质的较轻的链，而第二链是该多肽/蛋白质的较重的链。

5.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述多肽或蛋白质是肉毒杆菌神经毒素。

6.根据权利要求5的方法，其中所述多肽或蛋白质是血清型A的肉毒杆菌神经毒素(BoNT(A))或BoNT(A)的LH_N片段。

7.根据权利要求6的方法，其中所述环区域定义为位于形成二硫桥连的Cys残基之间的氨基酸序列；且其中所述方法不包括随后添加蛋白如内切蛋白酶的步骤，因为步骤(c)之后获得的多肽或蛋白是以其(生物学上)活性的双链结构存在的。

8.根据权利要求6的方法，其中将PRS序列VPXGS插入到BoNT(A)的氨基酸Leu₄₄₂和Lys₄₄₈之间，该BoNT(A)缺失了氨基酸443-447。

9.根据权利要求8的方法，其中将PRS序列VPRGS、VPYGS、VPHGS或VPQGS插入。

10.根据权利要求1-5之一的方法，其中将PRS序列VPXGS插入缺失了至少一个氨基酸的下列序列中：BoNT(B)的八肽Lys₄₃₈-Ile₄₄₅、BoNT(C1)的15聚体His₄₃₈-Asp₄₅₂、或BoNT(E)的13聚体Lys₄₁₃-Ile₄₂₅。

11.根据权利要求10的方法，其中将PRS序列VPXGS以17聚体GIITSKTKSLVPRGSKA或18聚体RGIITSKTKSLVPRGSKA的形式插入。

12.根据权利要求1-6之一的方法，其中所述蛋白质是杂合蛋白。

13.根据权利要求12的方法，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：

-效应物域，该域通过其酶促活性，能够抑制靶细胞中的分泌或杀死它们，或毒素域(成分A)；

-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)；以及

-细胞结合域，其赋予所述融合蛋白或杂合蛋白以细胞特异性(成分C)。

14.根据权利要求13的方法，其中所述杂合蛋白还包含作为成分D的易位域。

15.根据权利要求13或14的方法，其中所述毒素域(A)是白喉毒素、假单胞菌外毒素或蓖麻毒蛋白的域。

16.根据权利要求15的方法，其中所述毒素域(A)是假单胞菌外毒素的片段PE40(域III、域II和域Ib)或片段PE38(域III和域II)或蓖麻毒蛋白A链。