[发明专利]二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达

说明书

本发明申请是基于申请日为2006年1月20日，申请号为“200680002957.3”(国际申请号为PCT/DE2006/000088)，名称为“二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明的一个方面涉及通过在大肠杆菌宿主细胞中的重组表达产生双链形式的蛋白质的方法。本发明的另一个方面涉及双链生物学活性形式的蛋白质或多肽，其可通过前述的方法产生。

它们与相应的不呈现本发明特征的重组蛋白质/多肽相比，重要的优势在于不必为了定向切割多肽链而用特异性蛋白酶处理，因而产生方法得以显著简化。本发明的其它方面为：编码根据本发明的多肽/蛋白质的核酸；含有这样的核酸或核酸序列的载体；含有前述载体的宿主细胞；和最后含有双链和生物学活性蛋白质/多肽的药物制剂。

背景技术

梭菌神经毒素是神经细胞中钙依赖性神经递质的分泌的强抑制剂。在通过口腔摄入肉毒杆菌毒素(BoNT)(例如通过腐败的食物)之后，将出现被称作肉毒中毒的临床现象，其特征在于多种肌肉的麻痹。呼吸肌的麻痹最终可导致患者的死亡。在这种情况中，从神经到肌肉的信号转移在肌感受器(myoceptor)处被中断，因为运动神经元不再能够分泌乙酰胆碱。肉毒杆菌神经毒素通过蛋白水解切割参与该分泌过程的蛋白质，即所谓SNARE蛋白，来产生它们的抑制作用。在这里，不同血清型的神经毒素在SNARE蛋白和各自氨基酸序列的切割位点方面具有不同的特异性。BoNT(A)和BoNT(E)切割SNARE蛋白SNAP-25，而BoNT(C)将SNAP-25以及突触融合蛋白-1识别为底物。同样，血清型B、D、F和G的毒素以及破伤风毒素(TeNT)切割VAMP-2(synaprobrevin-2)(Schiavo等,1997)。

梭菌神经毒素是已知的最强的毒药。例如，导致剂量组所有小鼠的一半死于肉毒中毒的静脉给药致死剂量仅为5pg。大多数血清型的毒素当口服时也是有毒的，这是由于它们被包埋在复合蛋白质中，因此在通过胃肠道时免遭消化酶分解。人们还认为它们在通过小肠上皮细胞再吸收毒素中起作用(Fujinaga,1997)。

在过去的几十年中，血清型A和B的肉毒杆菌毒素已经在治疗中得到了应用。例如，通过定位注射仅最小剂量即可能松弛个体慢性痉挛的肌肉。一个特别的优点是长效，例如，BoNT(A)和BoNT(B)的效力多于三到六个月。最先的适应证包括张力失常，例如斜颈(torticollia)、睑痉挛和斜视；又增加了更多的适应证，例如多汗或用于平滑皱纹的美容治疗。肉毒杆菌作为治疗剂的市场增长迅速，相当重要的原因是发展了更多的适应证，而且在已有的用途中有了更加广泛的使用。在这样的背景下，人们尝试了对神经毒素在活性持续时间、效力和抗原潜力方面的性质加以改进。测试显示商业上可获得的制剂(可获自Allergen的BOTOX和可获自Ipsen-Beaufort的Dysport，均为BoNT(A)制剂；以及可获自Elan的Myobloc/Neurobloc，为BoNT(B)制剂)中含有的复合蛋白质对活性持续时间和效力不具积极影响，但是由于蛋白质量比具有相同活性的纯神经毒素制剂更高，可导致患者免疫反应的触发，使进一步的注射变得无效。

由于复合蛋白质在活性成分制剂中不是必需的，甚至是不利的，并且某些用于改进特性的修饰只能通过基因技术完成，因此人们对通过重组表达产生神经毒素存在强烈的需求，例如，通过在大肠杆菌中的表达(以这种方式产生的神经毒素不含前述的复合蛋白质)。此外由于肉毒杆菌毒素将被赋予不同的细胞特异性，将发展新的适应证。这里，通过重组毒素或毒素衍生物的途径同样是优选的。