[发明专利]一种大规模哺乳动物工程细胞培养方法

权利要求书

1.一种大规模动物工程细胞培养方法，包括以下步骤：

（1）细胞复苏及摇床培养：

将从液氮罐中取出的细胞株，在37℃水浴中复融，待细胞化开后置于含有50ml扩培培养基的250ml摇瓶中，放置于37℃、5%CO₂培养箱中，150rpm摇床培养2-3天，使摇瓶中细胞密度生长到1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml；

所述扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD Forti CHO培养基；

（2）扩培罐培养，包括在培养基中于悬浮液中培养细胞，分三级进行：

2L罐扩培：将摇瓶中密度1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml的细胞，以1:4～5的体积比例稀释到含有1.6L扩培培养基的2L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速200rpm；培养2-3天，使2L罐中细胞密度生长到1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml；

10L罐扩培：将2L罐中密度1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml的细胞以1:4～5的体积比稀释到含有8L扩培培养基的10L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，同时与NaHCO₃偶联，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速120rpm；使2L罐中细胞密度生长到1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml；

其中，上述的扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD Forti cho培养基；

100L罐扩培：将10L罐中扩培的密度为1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml的细胞，以1:4～5的体积比稀释到含有35-40L完全培养基的100L扩培罐中，所述的完全培养基为含有2mML-Gln的CD Forti cho培养基；培养工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速75rpm；在细胞培养的第4、6天各补料培养基Feed C一次，补料培养基的体积为完全培养基体积的11-13%；细胞培养的第7-8天，细胞密度为17×10⁶～19×10⁶cell/ml，此阶段细胞进入对数生长期，收集处在此对数生长期的细胞作为种子细胞准备转移到生产罐中进行生产罐培养；

（3）生产罐培养：

将步骤（2）中55-60L种子细胞无菌转移到含有55-60L完全培养基的150L细胞生产培养罐中，所述的完全培养基为含有2mM L-Gln的CD Forti cho培养基；培养工艺条件为：温度33℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速50rpm；在生产细胞罐中的第1天，补料培养基Feed C10-20L，使总体积达130L，每天取样计数，生产罐培养的第7-8天时，细胞活力下降到78-82%，收集细胞上清液进行纯化，得到纯化后的原液。

2.如权利要求1所述的大规模动物工程细胞培养方法，其特征在于步骤（2）的2L罐、10L罐的扩培，每一级扩培均使细胞密度生长到2.0×10⁶cell/ml。

3.如权利要求1所述的大规模动物工程细胞培养方法，其特征在于步骤（2）100L罐扩培中，控制完全培养基接种后体积为50L，补料培养基Feed C一次，各5L，补料后总体积为60L；细胞培养的第7天，细胞密度为18×10⁶cell/ml，收集此时的细胞作为种子细胞准备转移到生产罐中进行生产罐培养。

4.如权利要求1所述的大规模动物工程细胞培养方法，其特征在于所述工程细胞为表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株，表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的工程细胞株或表达重组抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的工程细胞株。